作者：刘磊 乔伟丽 祁友键 徐红 闫长栋
【摘要】 目的探讨硫化氢(h3S)合成酶胱硫醚-β-合成酶(CBS)在海马中的分布和表达是否受年龄因素的影响。方法用免疫组化和免疫印迹方法观察年轻(3月龄)和老年(24月龄)大鼠海马中CBS的分布和含量。结果CBS在年轻和老年大鼠海马中主要分布在颗粒细胞层和锥体细胞层，呈区域性分布，其中CA1区表达最多，CA3区、DG区表达较少;CBS在老年大鼠和年轻大鼠海马中的表达和分布没有变化。结论CBS在大鼠海马中呈区域性分布，CA1区表达最多，年龄不影响CBS的分布和表达。
【关键词】 硫化氢;胱硫醚-β-合成酶;海马
Abstract： ObjectiveTo explore the correlation between the distribution and expression of hydrogen sulfide (h3S) synthase cystathionine-β-synthase (CBS) in the hippocampus of young (3 months) and aged (24 months) rats. MethodsThe distribution and expression of CBS in the hippocampus of young and aged rats were determined by immunohistochemistry and Western blot analysis. ResultThe expression of CBS showed a regional distribution in the hippocampus of young and old rats， in which CBS was highly expressed in CA1 area， and much less expressed in CA3 area and DG area. Compared with young rats， there was no variation in the expression of CBS in hippocampus of aged rats. ConclusionThe expression of CBS showed a regional distribution in the hippocampus of young and old rats and had the top level of expression in CA1 region， with age factors unrelated in the distribution and expression of CBS.
Key words: hydrogen sulfide; cystathionine-β-synthase; hippocampus
众所周知，硫化氢(h3S)是一种具臭鸡蛋味的毒性气体。然而，1989年Warenycia等[1]在鼠、牛及人的大脑中发现有相对较高浓度的内源性h3S (50~160 mmol/L)，提示h3S可能具有重要的生理作用。大量的研究表明内源性h3S在神经系统、消化系统、心血管系统等均有重要生理作用，并参与了一些疾病的病理生理过程，被认为是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3类气体信号分子[2]。内源性h3S主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)和半胱氨酸转移酶催化半胱氨酸生成。CSE和CBS的表达具有组织特异性，其中CSE存在于心血管组织中，而CBS 主要存在于神经系统内[3-4]，参与中枢神经系统功能的调节。但是，CBS在脑中的表达和分布如何，衰老是否会引起脑组织中CBS的改变，目前网上查阅尚未见报道。本研究通过免疫组织化学和免疫印迹方法，探讨h3S合成酶CBS在年轻和老年大鼠海马中的分布情况以及衰老对CBS表达的影响。
1材料和方法
1.1主要试剂抗CBS抗体购于武汉博士德公司，山羊抗兔二抗、SP-6001免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，NBT/BCIP试剂盒购于Promega公司，其他试剂均为国产分析纯级。
1.2动物与分组清洁级雄性SD大鼠：年轻组(n=20)，3月龄，体重200~250 g;老年组(n=20)，24月龄，体重550~650 g。大鼠由徐州医学院实验动物中心提供(使用许可号：SYXK[su]2002-0038)，实验前自由饮水和进食。
1.3免疫组化实验动物用10%水合氯醛按0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉后打开胸腔，经心脏快速灌注生理盐水100 ml，再用40 g/L多聚甲醛( PB 配制，pH 7.4) 300 ml 灌注固定。取全脑，修块，浸入40 g/L多聚甲醛中后固定，4 ℃过夜。常规制备脑组织石蜡切片(5 μm)，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化;双蒸水洗2 min×3次， 3% h3O2室温作用10 min，去除内源性过氧化物酶的活性;双蒸水洗2 min×3次，枸橼酸盐抗原热修复15 min;0.01 mol/L PBS洗2min×3次，分别加一抗(CBS 1∶50) 4℃冰箱过夜。0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，加二抗室温孵育0.5 h;0. 01 mol/L PBS洗2 min×3次，DAB 显色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。光镜下观察到胞质或胞核内有黄色或者棕色颗粒者，即为阳性细胞。通过对阳性细胞进行检测，分析海马中CBS的分布情况。
1.4免疫印迹实验2组大鼠快速断头处死，取出海马，称重。每100 mg海马组织加入1 ml匀浆液充分匀浆，4℃、10 000 r/min离心10 min后取上清，按BCA试剂盒操作说明书操作，以牛血清白蛋白为标准蛋白测定蛋白含量，分装后立即使用或置-80℃冰箱备用。等量蛋白样品经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，以半干转方法转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上。转移后的NC膜经5% 脱脂奶粉封闭1 h后加入兔抗大鼠CBS一抗(1∶300)4℃过夜。用Washing buffer洗膜，加入相应的生物素化的二抗(1∶2 000)，室温2 h;Washing buffer洗膜后，以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。所得显色条带以Image J软件进行灰度值分析，以CBS/β-actin灰度比值表示CBS含量。
1.5统计学处理采用SPSS 13.0进行统计学分析，数据以±s表示，组间采用单因素方差分析及q检验进行差异显著性分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1海马CA1、CA3和DG区CBS的免疫组化染色结果结果显示，CBS在年轻和老年大鼠海马中分布在颗粒细胞层和锥体细胞层，呈区域性分布，其中CA1区阳性细胞表达最多，CA3区、DG区阳性细胞表达较少，而在海马中心区域则未见CBS阳性细胞分布。见图1。
2.2大鼠海马中CBS蛋白表达免疫印迹结果显示， CBS在年轻和老年大鼠海马中的含量差异无统计学意义。结果提示，年龄因素对CBS在海马中的表达量没有影响。见图2。图1年轻和老年大鼠海马中CBS的分布(SP两步法，×40，×400) 图2年轻和老年大鼠海马中CBS的含量
研究表明，CBS和CSE的表达具有组织特异性。CBS基因敲除后的小鼠脑内几乎检测不到h3S，证实了CBS是脑内产生h3S的主要合成酶 [5]。CBS在脑中主要分布在海马、小脑、皮质和脑干等部位，其中海马部位含量较高[6]。我们的实验结果显示：CBS在海马中主要分布在颗粒细胞层和锥体细胞层，呈区域性分布，其中CA1区表达最多，CA3区、DG区表达较少;年龄不影响CBS在海马中的分布和表达。CBS在海马中的分布方式可能与h3S在不同区域的具体功能相关。
h3S具有神经调节剂的功能。高于生理浓度的h3S会抑制兴奋性突触后电位(EPSP)，但基础浓度的h3S反而可以加强EPSP;在生理浓度范围内，内源性h3S可以提高海马CA1区长时程增强作用(LTP)[6]，说明h3S参与海马的学习记忆。我们的结果表明，CBS以CA1区表达最多，CA3区次之，DG区表达较少，这一分布结果与上述h3S的研究结果是相印证的。
h3S不仅具有神经调节剂的功能，还有神经保护剂的功能，有文献报道h3S具有减轻海马病理性损伤的作用[7]，除此之外，h3S还参与某些神经系统疾病的发生和发展过程[8-9]，其作为神经系统的一种神经性递质，对大脑功能的调节具有十分重要的作用。如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)患者脑中，h3S 水平严重降低[10]。我们的实验结果显示正常老年大鼠脑中CBS的表达和分布并没有发生变化，提示在老年大鼠大脑中，h3S仍发挥着比较重要的作用，可能具有阻止或防止脑组织或中枢神经系统功能退化等作用。
本实验结果显示CBS在海马中的表达有区域性差异，可能与不同海马分区的功能差异有关。 h3S在脑中生理作用及其在疾病发展过程中的作用机制尚未完全明了，与其他信号分子的相互作用亦有待于进一步研究，加强这方面工作，对于阐明神经系统疾病的发病机制及一些神经疾病的治疗和预防具有十分重要的意义。
【
参考文献
】[1]Warenycia MW， Goodwin LR， Benishin CG， et al. Acute hydrogen sulfide poisoning. Demonstration of selective uptake of sulfide by the brainstem by measurement of brain sulfide levels [J]. Biochem Pharmacol， 1989，38(6):973-981.
[2]owicka E， Betowski J. Hydrogen sulfide (h3S) - the third gas of interest for pharmacologists [J]. Pharmacol Rep， 2007，59(1):4-24.
[3]Kimura Y， Goto Y， Kimura H. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria [J]. Antioxid Redox Signal， 2010，12(1):1-13.
[4]Wang R. The gasotransmitter role of hydrogen sulfide [J]. Antioxid Redox Signal， 2003，5(4):493-501.
[5]Eto K， Kimura H. The production of hydrogen sulfide is regulated by testosterone and S-adenosyl-L-methionine in mouse brain [J]. J Neurochem， 2002，83(1):80-86.
[6]Abe K， Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator [J]. J Neurosci， 1996，16(3):1066-1071.
[7]Whiteman M， Cheung NS， Zhu YZ， et al. Hydrogen sulphide: a novel inhibitor of hypochlorous acid-mediated oxidative damage in the brain? [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005，326(4):794-798.
[8]Qu K， Chen CP， Halliwell B， et al. Hydrogen sulfide is a mediator of cerebral ischemic damage [J]. Stroke， 2006，37(3):889-893.
[9]Han Y， Qin J， Chang X， et al . Hydrogen sulfide and carbon monoxide are in synergy with each other in the pathogenesis of recurrent febrile seizures [J]. Cell Mol Neurobiol， 2006，26(1):101-107.
[10]Eto K， Asada T， Arima K， et al. Brain hydrogen sulfide is severely decreased in Alzheimer′s disease [J]. Biochem Biophys Res Commun， 2002，293(5):1485-1488.