【摘要】 目的 观察局部灌注异丙酚对大鼠前额叶皮质细胞外液中谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）含量的影响。方法 选用30只成年雄性大鼠随机分为实验组（n＝24）和对照组（n＝6），于前额叶皮质处放置微透析探头。实验组以2 μl/min灌注含不同浓度异丙酚（按照异丙酚浓度分为1、3、10、30 μmol/L 4个亚组，每组n=6）的人工脑脊液;对照组灌流液中不含异丙酚。每10 min收集灌流液并应用反相高效液相色谱法测定其中谷氨酸和GABA浓度。结果 局部灌注异丙酚1 μmol/L 10 min后，各时点灌流液中谷氨酸含量与基础值比较差异无统计学意义（P&>0.05）。异丙酚3 μmol/L局部灌注后，灌流液中谷氨酸含量于第10、20 min时降至基础值的60%（P&<0.05），随后逐渐回升至基础值水平。前额叶皮质局部灌注异丙酚10 μmol/L 10 min后，灌流液中谷氨酸含量于第10 min至30 min显著低于基础值（P&<0.01或&<0.05）。局部灌注异丙酚30 μmol/L 10 min后，灌流液中谷氨酸含量于第10 min至40 min均显著降低（P&<0.01或&<0.05）。而不同浓度的异丙酚局部灌注后，各时点灌流液中GABA含量与各基础值比较差异无统计学意义（P&>0.05）。结论 异丙酚可降低大鼠前额叶皮质细胞外液谷氨酸含量，而对GABA含量不产生影响。
【关键词】 二异丙酚 额叶前皮质 细胞外液 谷氨酸 γ-氨基丁酸（GABA）
Abstract:Objective To investigate the effect of propofol locally perfused into the rat prefrontal cortex (PFC) on glutamate and GABA extracellular levels.Methods Thirty male adult rats were randomly pided into 4 groups: test groups and 1 control group (n=6 each)， with a microdialysis probe inserted into the PFC. In the test groups， artificial cerebrospinal fluid (aCSF) containing different concentrations of propofol (1， 3， 10 and 30 μmol/L respectively) was perfused into the PFC at 2 μl/min; in the control group， only aCSF was infused. The perfusate was collected every 10 min throughout the experiment to measure the concentrations of glutamate and GABA in the perfusate by reversed-phase high performance liquid chromatography.Results The glutamate level in the perfusate was not changed when propofol was 1 μmol/L (P&>0.05)， but it decreased significantly for 10 and 20 min when propofol was 3 μmol/L (P&<0.05). As the concentration of propofol was further increased (to 10 and 30 μmol/L) the depression of glutamate level would extend to 40 min (P&<0.01 or 0.05). However， the GABA level in the perfusate was not altered throughout the perfusion with different concentrations of propofol (P&>0.05).Conclusion Propofol reduces the glutamate extracellular level in rat intact prefrontal cortex， but has no effect on the GABA level.
Key words: propofol; prefrontal cortex; extracellular fluid; glutamate; γ-aminobutyric acid (GABA)
异丙酚为目前临床最常用的全身麻醉药，其临床效应主要为意识及记忆消失。哺乳动物大脑联合皮质在意识、记忆等高级认知功能的调节中发挥着极其重要的作用，而前额叶皮质作为联合皮质的重要部分，与高级认知功能有着更加密切的关系［1-2］。并且临床研究亦发现，异丙酚产生催眠效应的同时主要使前额叶皮质内血流量下降［3］。因此异丙酚引起的临床效应可能与作用于前额叶皮质有关。在哺乳动物前额叶皮质内，谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）是最重要的兴奋性和抑制性神经递质［4］，其含量的95%以上存在于细胞内（突触前膜的囊泡和胞质中），而细胞外液所占比例很低，但前额叶皮质生理功能的发挥取决于细胞外液中的递质含量［5］。故研究异丙酚的临床效应与前额叶皮质细胞外液中谷氨酸和GABA含量的关系具有重要意义。本实验应用在体微透析技术观察前额叶皮质内局部灌注异丙酚对前额叶皮质细胞外液中谷氨酸和GABA含量的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物与仪器 Sprague-Dawley成年雄性大鼠，体重200～250 g，由中国科学院上海生命科学研究院实验动物中心提供。实验前1周，将大鼠饲养于35 cm×35 cm×40 cm笼中，光照/黑暗交替（12/12 h， 8∶00am-8∶00pm为光照时间），环境温度为（24±2）℃，自由摄取水和食物。微透析探头（CMA/12，同心圆型）、外套管（CMA/12）、微灌注泵（CMA/100）均为瑞典Camegie Medicine公司产品。
1.2 人工脑脊液（aCSF）的制备［6］ 微透析灌流液应用aCSF，其成分为（mmol/L）：NaCl 126.5，NaHCO3 27.5，KCl 2.4，Kh3PO4 0.5，CaCl2 1.1，MgCl2 0.83，Na2SO4 0.5，葡萄糖11.8。应用0.1 mol/L NaOH将pH值调至7.3，并用0.22 μm微孔滤膜过滤，除去杂质，于0℃～ 4℃下保存，充以95% O2/5% CO2混合气体至饱和状态。
1.3 分组 将30只大鼠随机分为实验组（n＝24）和对照组（n＝6），于前额叶皮质处放置微透析探头。实验组以2 μl/min灌注含不同浓度异丙酚（按照异丙酚浓度分为1、3、10、30 μmol/L 4个亚组，每组n=6）的aCSF，对照组则只灌注aCSF。
1.4 大鼠前额叶皮质微透析实验操作 实验均在10∶00am-3∶00pm之间进行，以排除生物节律对前额叶皮质细胞外液中谷氨酸和GABA水平的影响。将大鼠自笼中取出，动作尽量轻柔以减少激惹。应用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射，待麻醉起效后将大鼠颅骨固定于脑立体定位仪上（江湾Ⅱ型），于前额叶皮质处埋置微透析外套管。前额叶皮质立体定位依据大鼠脑图谱［7］：A/P 3.3 mm，L/M 1.2 mm，V/D 5.0 mm。用牙托粉固定外套管，将大鼠放于笼中饲养。48 h后取出外套管管芯，放置微透析探头，连接微灌流泵，以2 μl/min持续灌注aCSF 60 min作为平衡期，使得灌流液中神经递质含量达到稳定。在随后的30 min收集灌流液，每10 min 1次共3次，并取3次灌流液中谷氨酸和GABA含量的平均值作为基础值。然后实验组经微透析探头局部灌注不同浓度的异丙酚（1 ～ 30 μmol/L）持续10 min（对照组灌注不含异丙酚的aCSF），然后换为正常aCSF灌流70 min。每10 min收集1次灌流液，保存于-70℃冰箱，应用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定灌流液中的谷氨酸和GABA含量。
1.5 统计学处理 计量资料以±s表示，不同时点细胞外液中谷氨酸和GABA含量以基础值的百分比表示。采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，组内与基础值的比较采用双因素方差分析和Dunnett-t检验，各组间基础值的比较采用单因素方差分析。P&<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组间微透析灌流液中谷氨酸和GABA基础值的比较 异丙酚各浓度组和对照组中细胞外液谷氨酸和GABA的基础值差异无统计学意义（P&>0.05）。见表1。表1 各组间微透析灌流液中谷氨酸和GABA基础值的比较
2.2 各组灌流液中谷氨酸含量在不同时点的变化 对照组中，灌流液中谷氨酸含量于各时点与基础值比较差异无统计学意义（P&>0.05）。局部灌注异丙酚1 μmol/L 10 min后，各时点灌流液中谷氨酸含量与基础值比较差异亦无统计学意义（P&>0.05）。异丙酚3 μmol/L 局部灌注10 min后，灌流液中谷氨酸含量于第10、20 min时降至基础值的60%（P&<0.05），随后逐渐回升至基础值水平。局部灌注异丙酚10 μmol/L 10 min后，灌流液中谷氨酸含量于第10 min时降至基础值的34%（P&<0.01），于第20 min、30 min时亦显著低于基础值（P&<0.01或&<0.05）；尔后逐渐回升至基础值水平。异丙酚30 μmol/L局部灌注10 min后，灌流液中谷氨酸含量变化趋势与局部灌注异丙酚10 μmol/L 10 min较为相似。于第10 min时降至最低点（P&<0.01），尔后逐渐回升，但直到第40 min，谷氨酸含量仍显著低于基础值水平（P&<0.01或&<0.05）。见图1。
2.3 各组灌流液中GABA含量在不同时点的变化 局部灌注各浓度异丙酚后，各时点灌流液中GABA含量与各基础值比较差异无显著性（P&>0.05），见图2。
在哺乳动物中枢神经系统内，前额叶皮质是联合皮质的重要组成部分，外界信息及各种刺激信号到达中枢神经系统后，均需在前额叶皮质内进行整合加工［8］。近年来发现，前额叶皮质内的谷氨酸在调节意识形成和意识不同水平中发挥着极其重要的作用［8］。谷氨酸可激活NMDA受体从而引发Ca2+大量内流，通过一系列胞内反应，如激活Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ等，最终对意识形成以及意识程度进行调控［9］。研究表明，硫喷妥钠腹腔注射或前额叶皮质局部灌注可显著降低细胞外液谷氨酸的含量［10］。因此异丙酚降低前额叶皮质细胞外液中谷氨酸含量可能是其引起意识消失等临床效应的原因之一。
神经传递很大程度上由突触间隙内的神经递质浓度决定，而突触间隙和细胞外液中神经递质浓度的关系尚不十分清楚，但在一定程度上细胞外液神经递质浓度的变化可反映突触间隙的递质浓度的改变。本实验发现异丙酚可降低前额叶皮质细胞外液中谷氨酸含量，而谷氨酸细胞外液浓度由突触前膜释放和重摄取来决定，其中神经末梢和胶质细胞在重摄取中发挥重要作用［11］。研究表明，异丙酚可抑制大鼠海马突触体或皮质脑片谷氨酸的Ca2+依赖性释放［12］，而对谷氨酸的重摄取并不产生影响，因此异丙酚降低细胞外液谷氨酸含量可能是由于抑制突触前膜谷氨酸的释放造成的。
前额叶皮质内，GABA能神经纤维末梢与谷氨酸能神经纤维末梢可形成轴突-胞体或轴突-轴突突触，从而可抑制锥体神经元的活性及其末梢释放谷氨酸，对前额叶皮质的兴奋性输出发挥重要的调节作用［13-15］。本实验中，异丙酚对细胞外液中GABA含量无显著影响，因此认为前额叶皮质中细胞外液GABA可能不参与异丙酚的中枢作用。但以往研究发现应用GABAA受体拮抗剂可显著减弱异丙酚对皮质脑片释放谷氨酸的抑制作用［12］，表明GABAA受体可介导异丙酚对谷氨酸释放的抑制作用，因此本实验中异丙酚降低细胞外液谷氨酸含量亦可能与其直接作用于GABAA受体有关，但需进一步研究证实。
结论： 异丙酚可降低大鼠前额叶皮质细胞外液谷氨酸含量，而对GABA含量不产生影响。
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