作者：米琰 杨海扣 于水 季永 曾因明
【摘要】 目的观察鞘内注射硫化氢供体硫氢化钠(NaHS)和腹腔注射胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(PAG)对甲醛炎性痛大鼠的行为学影响，探讨小分子气体硫化氢(h3S)在炎性痛中的作用。方法成年雄性SD大鼠40只，随机分为5组(n=8)：疼痛模型组、人工脑脊液组、NaHS组、生理盐水组、PAG组。注射溶媒、NaHS或PAG后，向大鼠一侧足底皮下注射5%甲醛溶液，观察60 min，进行疼痛行为学评分。结果疼痛模型组、人工脑脊液组和生理盐水组的疼痛行为学评分差异无显著性(P&>0.05);在第二相反应时段，与疼痛模型组相比，人工脑脊液组和生理盐水组的疼痛行为学评分无统计学差异(P&>0.05)，NaHS组和PAG组的疼痛行为学评分明显降低(P&<0.05)。 结论鞘内注射NaHS和腹腔注射PAG均能对甲醛炎性痛大鼠产生镇痛作用。
【关键词】 硫化氢;硫氢化钠;DL-炔丙基甘氨酸;疼痛;甲醛试验
Abstract: ObjectivesTo evaluate the effect of intrathecal pretreatment of sodium hydrosulfide (NaHS)-hydrogen sulfide donor and intraperitoneal injection of cystathionine-γ-liase inhibitor PAG on the ethology of rat with formalin-induced inflammatory pain， and to explore the role of hydrogen sulfide， a small-molecule gas in inflammatory pain. MethodsThere were no significant statistical differences in the scores of pain-induced ethology between the pain model group， ACSF group and the solvent group (P&>0.05). In the second phase of response， there were no significant statistical differences in the scores of pain-induced ethology in ACSF group and the normal saline group， as compared to the pain model group (P&>0.05)， while those in NaHS group and PAG group showed a significant decrease (P&<0.05). ResultsControl group and solvent group of pain behavioral score had no significant statistical difference(P&>0.05). In the second period， compared to control group， rat pain behavior scores in ACSF group and saline group had no significant statistical difference(P&>0.05)，but that of NaHS group and PAG group reduced significantly(P&<0.05). ConclusionBoth intrathecal injection of NaHS and intraperitoneal injection of PAG could produce anti-nociceptive effects.
Key words: h3S; NaHS; PAG; pain; formalin test
h3S作为继NO、CO后的第3种内源性气体信号分子，是近20年来才开始对其生理、病理方面的研究和认识。长久以来，对于h3S的研究主要集中于它的毒性作用，如中枢神经系统和呼吸系统的影响。h3S具有与NO、CO类似的特性：小分子量气体，不通过受体发挥作用，可以自由通过细胞膜，其生成受内源性关键酶的调节，生理浓度时有很明确的特殊功能等。h3S可内源性产生，可存在于生物体内的多个系统中，并通过多种调节方式和信号转导形式发挥生理病理作用。近年来有研究表明h3S在炎性痛中也发挥了调节作用[1-2]。
1材料和方法
1.1动物和分组 雄性SD大鼠40只，体重200～250 g，由徐州医学院实验动物中心提供。动物饲养适应环境24 h后进行实验，随机分为5组(n=8)：疼痛模型组、人工脑脊液组、NaHS组、生理盐水组、PAG组。人工脑脊液组(20 μl)和NaHS(Sigma公司，美国)组(40 μmol/kg，20 μl)在足底注射前5 min进行鞘内注射;生理盐水组(1 ml)和PAG(Sigma Aldrich公司，美国)组(20 mg/kg，1 ml)在足底注射前20 min进行腹腔注射。
1.2大鼠鞘内注射先准备一个布套，开口以大鼠头部2倍大左右为宜(可用普通白线手套代替)。抓鼠尾将大鼠提起，张开套口顺势将大鼠头部放入，左掌压住袋口盖住鼠身，以拇中二指按压骶骨两侧固定，示指按在双侧骶骨前缘连线正中点皮肤上，摸出L5～L6间隙(由骶骨中线向上摸，可摸到一较突出棘突，为L5棘突，其下间隙为进针点)指示进针位点，右手持25 μl 微量进样器与脊柱上方约成60°～70°进针通过椎间隙触到骨质后，减小10°左右继续缓慢推进，以鼠尾突然出现侧摆或后腿突然出现抽动为成功标志。注入药物(容积=20 μl)，时间约5 s ，稍停2 s后拔针[3]。
1.3大鼠甲醛实验行为学观察及评分大鼠甲醛足底炎性痛模型可靠经典，制造方法简单[4]。予5%甲醛50 μl注射于大鼠一侧足底皮下，即可造成大鼠局灶炎性痛。注射后立刻出现自发痛行为反应。此疼痛行为反应呈双相性：第一相反应持续0～15 min，0～5 min疼痛行为反应达高峰，5～15 min明显减弱;第二相反应从15 min持续至60 min，并出现明显的化学刺激性局部炎性反应。2 h后大鼠足部的水肿更加明显，可持续24 h不消退。
根据Dwbuisson和Dennis设计和改进的疼痛定量评估方式，对各组大鼠行为表现进行连续观察记录，并计算60 min内行为学变化评分值。行为学观察采用双盲法，自足底注射后每5 min记录一次。大鼠疼痛行为分为4级：0级——两足后足掌平放在地面，活动无异常;1级——注射足掌轻微接触地面，活动时有跛行;2级——注射足抬起，不接触地面;3级——大鼠舔咬或拍动注射足。疼痛加权评分(pain intensity-scoring， PIS)计算方法：PIS= T1+2×T2+3×T3/5×60。其中T1、T2、T3分别为5 min时段内出现的1、2、3级行为的时间。
1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行处理。组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。P&<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1疼痛模型组、人工脑脊液组、NaHS组在不同时段PIS评分比较3组在第一相反应各时段的PIS评分无统计学差异;在第二相反应的各个时段，疼痛模型组和人工脑脊液组的PIS没有统计学差异，而NaHS组的PIS评分明显降低(P&<0.05)(表1)。
2.2疼痛模型组、生理盐水组、PAG组在不同时段的PIS评分比较各组在第一相反应各时段的PIS没有统计学差异;在第二相反应的各时段，疼痛模型组和生理盐水组的PIS没有统计学差异，而PAG组的PIS明显降低(P&<0.05)(表1)。表1各组在不同时段PIS评分比较
3讨论
目前，对于内源性气体信号分子h3S在炎性痛中所起的调节作用有不同的观点：有学者认为无论内源性或外源性的h3S都可在外周水平起到致痛作用，但也有学者认为h3S可直接作用于伤害性感受神经元产生镇痛作用[5]。
Distrutti等[7]发现在大鼠结直肠炎性痛模型中，给予h3S供体——NaHS和ATP-429可产生剂量依赖性的镇痛效应，而ATP敏感性K+通道抑制剂格列苯脲和一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)均能降低这种镇痛效应。这与本实验中鞘内注射NaHS可降低甲醛炎性痛大鼠的行为学评分的结果一致，说明给予外源性h3S确实在炎性痛过程起到了调节作用。
Kawabata等[8]在大鼠足底分别注射NaHS和L-半胱氨酸(内源性h3S的底物)，都可迅速引起痛觉过敏，并可在大鼠脊髓背角中检测出即刻早期基因c-fos的表达。NaHS诱导的这种痛觉过敏可被氧化剂DTNB、溴琥胺、T型Ca2+通道阻滞剂咪拉地尔所阻滞。而L-半胱氨酸所诱导的痛觉过敏可被CSE阻滞剂PAG和β-氰丙氨酸(BCA)抑制。这证明h3S在外周水平可能起致痛作用。本实验中通过腹腔注射PAG抑制内源性h3S，从而降低甲醛炎性痛大鼠的行为学评分也得到了同样结论。
对于h3S在炎性痛中表现出的这种双相性作用，目前仍有许多不同的见解。Cunha等[9]认为，h3S的致痛效应主要是因为白细胞移行的上调，而镇痛效应是由于对调节伤害性感受器敏感性的KATP通道的直接阻滞所致。因为内源性h3S存在于哺乳动物的多种组织和器官，并参与了多种系统和生理、病理过程的调节，以及在炎性痛过程中多种调节机制的参与，使得确定h3S在炎性痛中的作用变得困难。而且，各实验室所使用的不同实验模型和有差异的实验操作也可能会造成实验结果的不同，在Distrutti等[7]的实验中h3S对结直肠平滑肌顺应性的改变是否影响了镇痛效应的测定，外源性h3S的给予是否会影响实验动物的意识进而影响监测的准确性等，仍有待探讨。
h3S本身是一种有潜在毒性的气体，生理学和毒理学效应界限非常窄，加之其广泛多样的生物效应，使我们在h3S的疼痛双相性调节研究上有很大难度。有关h3S在炎性痛中精确调节作用的阐明，有待在今后的研究中不断探索。
参考文献
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[7]Distrutti E， Sediari L， Mencarelli A， et al. Evidence that hydrogen sulfide exerts antinociceptive effects in the gastrointestinal tract by activating KATP channels [J]. J Pharmacol Exp Ther， 2006，316(1):325-335.
[8]Kawabata A， Ishiki T， Nagasawa K， et al. Hydrogen sulfide as a novel nociceptive messenger [J]. Pain，2007，132(1-2):74-81.
[9]Cunha TM，Dal-Secco D， Verri WA Jr， et al. Dual role of hydrogen sulfide in mechanical inflammatory hypernociception [J]. Eur J Pharmacol， 2008， 590(1-3):127-135.