作者：张新江，杨金升，常丽英，殷小平，王苇，张苏明，方思羽
【关键词】 脑水肿
【Abstract】 AIM: To determine the characteristics of perilesion edema during 1-7 days in pigs with intracerebral hemorrhage (ICH). METHODS: With injection of 2.5 mL autologous artery blood into right frontal lobes， 15 pigs (10-15 kg) had fluidattenuated inversionrecovery (FLAIR)， diffusion weighted imaging (DWI) and 1Hmagnetic resonance spectrum (1HMRS) by 1.5 T MR at 24 hours (n=15)， at 72 hours (n= 9) and on day 7 (n=5). In 4 animals， bloodbrain barrier permeability was observed by leakage of Evan’s blue at 24 hours (n= 4). RESULTS: The edema was located around hematoma on the sequence of FLAIR at 24 hours after ICH. The perilesional apparent diffusion coefficiency (ADC) increased and no lactic acid peak was observed by 1HMRS from 24 hours to day 7 in all the animals but one. CONCLUSION: During 1-7 days after ICH， the vasogenic edema dominates around the hematoma. Only in case of massive hemorrhage， ischemia may coexist.
【Keywords】 pigs; cerebral hemorrhage; brain edema; diffusion weighted imaging; 1HMRS; bloodbrain barrier
【摘要】 目的：阐明脑出血1～7 d时血肿周围水肿的演变规律和性质. 方法：将15只质量10～15 kg的仔猪动脉血2.5 mL注入右侧额叶，在24 h(n=15)，72 h(n=9)和7 d(n=5)后用1.5T MR行FLAIR（液体衰减返转恢复快速自旋回波序列）， DWI（弥散加权成像）和血肿周围组织的1HMRS（质子波谱分析）； 病理观察4只动物24 h时血肿周围组织对伊文思蓝的外渗以确定血脑屏障的完整性，同时对各时间点处死动物的脑组织进行常规病理观察. 结果：FLAIR显示24 h至7 d时血肿周围组织水肿严重，局部平均表观弥散系数（ADC）升高，24 h时灶周大量伊文思蓝外渗，但水肿区1HMRS分析除1例大量出血者外均无乳酸峰. 结论：中等量脑出血时血肿周围以血管源性脑水肿为主，并未发现缺血性损害，但不排除大量出血时存在缺血性损害的可能性.
【关键词】 猪；脑出血；脑水肿；弥散加权成像；质子波谱分析；血脑屏障
0引言
脑出血后血肿周围水肿、继发性神经组织损害是影响患者预后的主要因素之一，也是近年来研究关注的焦点. 由于研究方法、观察时机的不同，对脑出血后是否存在缺血性损害以及其程度尚存在争议［1，2］. 磁共振弥散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）和质子波谱（1H MR spectrum， 1HMRS）分析能在活体研究脑结构和代谢变化，已用于急性脑缺血的研究［3］. 但由于脑出血患者病情危重以及血肿内顺磁性物质的影响，故该类研究较少. 我们采用猪脑叶出血模型，通过1.5 T磁共振对血肿周围组织进行在体动态扫描观察，试图初步阐明血肿周围水肿的性质和演变规律，为进一步研究提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料
体质量10～15 kg，2～3 mo龄仔猪15只，雄雌不拘，购自武汉畜牧所农场；伊文思蓝和戊巴比妥钠由美国进口，上海试剂厂分装； EPIMRI（GE公司Signa 1.5 T）设备由同济医院磁共振室提供；PIAS1000型高清晰度多媒体图像分析系统（同济医科大学清平影像工程公司生产）由同济医学院病理教研室提供.
1.2方法
1.2.1动物模型用30 g/L戊巴比妥钠溶液35 mg/kg静脉注射麻醉动物，参考Wagner等［4］的方法建立猪脑叶出血模型，但改为两次注射. 即将动物头顶部去毛后常规消毒、铺无菌单，沿矢状缝、冠状缝做T字型切口，暴露冠状缝和矢状缝. 用直径2 mm的牙钻在中线右侧11 mm、冠状缝前10 mm处钻一小孔至硬脑膜外，注意不损伤硬脑膜. 将一带有内芯、已被截为14 mm长的18G留置针垂直刺入脑内，去除内芯. 右侧股动脉抽血1 mL，将注射器连接在一10 cm长的软管上，排除空气. 该软管外径稍小于留置针内径，在软管外做一标记，使软管恰好达留置针的前端为度，留置针与软管紧密接触而无血液反流. 通过软管注入动脉血0.5 mL，间隔5 min后再次抽取股动脉血3 mL，注入2 mL，每次注射在2 min内完成. 骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤. 分别在24 h(n=15)，72 h(n=9)和7 d(n=5)接受磁共振检查.
1.2.2动态MRI
1.2.2.1扫描序列和参数在模型成功后将动物送入MR设备中，用表面线圈(QUADKNEE)，层厚4 mm，间距1 mm做轴位扫描，距阵256×256. DWI采用SEEPI序列、液体衰减返转恢复快速自旋回波序列(fluidattenuated inversionrecovery，FLAIR) 成像，TR=10000 ms，TE=90.5 m，扩散梯度因子b=1000 s/mm2; FLAIR， TR=8002 ms， TE=133 ms. 同时用点解析波谱对血肿周围组织进行分析，采用多体数（TR=1500 ms， TE=144 ms）和单体数（TR=1500 ms， TE=35 ms）2种扫描参数.
1.2.2.2计算病灶体积在发病后用GE公司提供的eFilm软件，根据多田氏公式，病灶体积（cm3）=π×病灶最大层面的长轴×短轴×层数×层厚÷6，计算各个序列、不同时期的病灶体积（包括血肿和灶周水肿）.
1.2.2.3计算平均表观弥散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）在FLAIR显示血肿周围信号最高的层面，取血肿周围4个感兴趣区（region of interest）以及对侧相应部位，计算其平均ADC值. 在ADC map图上，如出现局部ADC值较对侧皮层降低和升高并存时，分别计算其ADC值.
1.2.2.4乳酸的定性分析对波谱基线上共振峰位于1.33 ppm(part per million)附近的乳酸峰进行定性分析，在该共振峰范围内，单体数（TE=35 ms）显示正置双峰，同时多体数(TE=144 ms)显示为倒置双峰，即认为该双峰为乳酸共振峰. 未计算峰值下的面积做半定量分析.
1.2.3测定组织干湿质量比在各时间点处死动物，取血肿周围和对侧半球相应额叶皮层组织少许，放入一已称取质量的冻存管内，电子天平（METT AE200）称取质量后放入100℃烤箱内24 h，再次称其质量，组织干湿质量比（%）=(湿质量-干质量)/湿质量×100%.
1.2.4病理观察①血脑屏障观察对4只动物在模型成功后立即耳静脉注射20 g/L伊文思蓝溶液1 mL/kg，在24 h完成MRI检查后处死，快速取脑，以针道为中心，间隔4 mm切片、标本拍照，观察血肿周围组织伊文思蓝的外渗情况. ②血肿体积计算和光镜观察将各时间点处死动物的脑组织间隔4 mm切片，拍照，在PIAS1000型高清晰度多媒体图像分析系统计算血肿体积. 取血肿周围和对侧半球相应额叶皮层，常规方法进行石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察.
统计学处理：实验结果以x±s表示，用SPSS(版本10.0)统计软件包进行多个样本均数比较的方差分析，方差不齐时改用秩和检验，血肿周围和对侧相应皮层ADC值的比较用配对t检验，P&<0.05为相差具有显著性.
2结果
2.1MR显示的病灶体积脑叶出血后MR显示的病灶体积（包括血肿和灶周病变，Tab 1，Fig 1）的比较发现，FLAIR显示病灶在24 h和72 h均明显大于7 d时 （秩和检验，P均&<0.01）；3组之间DWI显示的病灶差异显著（P&<0.01）.表1脑叶出血后FLAIR，DWI显示病灶体积(cm3)动态变化（略）
2．2灶周和对侧皮层ADC值的比较脑出血后灶周和对侧相应皮层ADC值为24 h：（129.7±15.9）×105 mm2/s和（82.5±7.8）×105 mm2/s（Fig 2）;72 h: （121.2±7.1）×105 mm2/s和（81.4±6.7）×105 mm2/s;7 d：（119.1±12.8）×105 mm2/s和（80.5±7.1）×105 mm2/s，各时间点灶周和对侧皮层比较均有显著性差异（P均&<0.01）.
2.4灶周组织干湿质量比的变化灶周组织干湿质量比24 h（n=6）为（83.5±1.4）%，72 h（n=4）为(82.9±2.0)%，7 d（n=5）为（80.6±0.9）%，与其自身血肿对侧皮层比较明显增加［24 h（77.2±0.9）%，P&<0.01；72 h(76.7±0.9)%， P&<0.01（秩和检验）；7 d(76.2±1.5)%，P&<0.05］，7 d时灶周组织干湿比小于24 h和72 h时（P均&<0.05），后二者比较无显著性差异（P&>0.05）.
2.5病理观察24 h（n=6）血肿呈不规则形状，沿额叶脑回的白质分布，血肿内含有较多的液体成分而较为松软，血肿周围脑白质有较明显蓝染(Fig 4)，体积为(2.31±0.22) cm3，72 h（n=4）血肿内液体成分明显减少，体积为（1.72±0.35）cm3，较24 h明显缩小(P&<0.05）. 7 d（n=5）时则血块变得较坚实，无液体成分，体积为(1.42±0.40) cm3，小于24 h时（P&<0.01），与72 h时比较差异无显著性（P&>0.05）. 24 h时在光镜下可看到血肿周围组织高度肿胀，大量中性白细胞浸润，部分神经细胞变性、坏死，72 h血管周围可看到大量吞噬细胞. 对侧皮层变化不明显.
3讨论
脑出血后灶周是否存在缺血性损害是近年来争论的焦点，由于以往多采用离体观察，导致研究结果不一致，甚至相反［1，2］. MRI新技术使在体研究组织代谢变化成为可能，但由于脑出血患者病情多较危重，难以耐受动态扫描，因此仅有小样本临床研究［5］. 猪具有白质发达、体质好、脑容量较大等优点，是脑出血研究的理想对象［4，6］，因此我们采用乳猪脑出血模型，通过动态MRI，试图阐明脑出血后血脑屏障的破坏规律以及脑水肿的性质.
生物体内的水分子根据其弥散速率分为结合水和自由水，前者由于与大分子物质结合或受膜结构的限制，弥散较慢，而后者则相反. 水的弥散速率常用表观弥散系数（ADC）作为衡量指标，DWI可通过对组织ADC值的观察，结合FLAIR等序列对组织内水的性质作出判断. 如脑缺血超早期细胞毒性水肿时局部ADC值降低，而血管源性水肿时则升高［3］. 1HMRS是近年来兴起的新技术，可通过观察生物体内不同物质在磁场中的化学位移对其作出定量和定性分析，是在体研究组织代谢变化的理想方法. 我们发现，脑出血后24 h血脑屏障广泛开放，病理显示血液中与血浆蛋白结合的伊文思蓝外渗，血肿周围组织蓝染，可见此时的ADC值增加是血管源性脑水肿的结果. 在1 wk的动态观察中除1例血肿较大者灶周局部ADC值降低外，其他动物均显示ADC值升高，同时，灶周组织1HMRS分析发现，中等量出血者灶周均未发现乳酸峰，仅1例大量出血者出现典型的乳酸峰（Fig 3）. 众所周知，乳酸是乏氧代谢的产物，可见中等量出血时无脑缺血证据，为血管源性脑水肿，但大量出血时灶周可能存在细胞毒性脑水肿，即脑缺血. Carhuapoma等［7］也报道了1例大量出血（80 mL）患者血肿上方ADC降低，推测与大量出血引起颅内压升高，局部灌注不良导致脑缺血有关. 此外我们还发现，猪脑出血后24～72 h灶周水肿即达高峰，7 d时明显消退，这与人类脑出血后水肿持续时间较长有所不同(临床研究另文报道），可能与实验对象为健康动物、出血量较人类小等因素有关.
总之，通过动态MR和1HMRS分析证实，中等量脑出血后1～7 d血肿周围为血管源性脑水肿，仅在大量出血时可能存在缺血性损害， 脑水肿的发生和发展与血肿释放的凝血酶等成分关系更为密切［8，9］. 以往认为脑出血后灶周存在类似于脑梗死半暗带的传统观点显然不适合于中等和小量出血者.
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