作者：何念海，赵文利，王宇明
【关键词】 ，骨髓间充质干细胞
【Abstract】 AIM: To establish and optimize the induction and differentiation condition for human fetal marrow mesenchymal stem cell (MMSCs) differentiation into hepatocytelike cells， observe the differentiation procedure and identify the phenotypes of MMSCs. METHODS: MMSCs， isolated from fetal marrow， were induced in vitro as the following six groups: control group， induction groups 1-5. Morphological changes and cytobiological characteristics of the induced MMSCs were observed during induction. Expression of hepatocyte markers such as ALB and CK18 was measured with immunohistochemistry. RESULTS: Cells in control group kept the long spindle shape， with shape agent as 4.5±1.0 and small size， proliferated quickly， submitted typical fibroblast whirlpool or flamboyancy growth. Five to seven branches were observed at the late culture period， no cell rounded， and the rate of dikaryocyte was less than 0.1%. They gradually aged， the amount of granules increased， and there was no expression of ALB and CK18. Branches of cells in all induction groups decreased during culture， and 1-3 branches were common. Cells without matrix kept long spindle shape growth， and part of the induction cells with matrix changed from long to round in shape and shape agent reduced. AZA pretreatment inhibited the cell hyperplasia， and cell changed from long to short in shape. PDGFBB pretreatment had no inhibition to cell proliferation， and cells branched easily. Immunohistochemical staining in all the induction groups showed that ALB and CK18 expressed positively at day 21. In induction groups 2 to 5， the rate of cell rounding and dikaryocytes and ALB and CK18 positive cells were higher than those in control group and induction group 1 (P&<0.05). CONCLUSION: Under noserumculture condition， high ratio hepatocytelike cells in induced MMSCs can be obtained by the condition of induction group 4: in which 10 g/L Matrigel is used as matrix， MMSCs are pretreated with 2.5 mmol/L AZA for 10-12 h， and HGF 10 μg/L＋FGF4 10 μg/L， used as promoters， are added into HGM medium.
【Keywords】 marrow mesenchymal stem cells; hepatocytelike cells; cell differentiation; induction
【摘要】 目的：建立和优化骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells， MMSCs)向类肝细胞诱导分化的条件及分化过程观察、鉴定. 方法：采用体外分离培养的MMSCs为研究对象，设计不同的诱导分化条件进行体外诱导，观察细胞诱导分化过程中形态结构变化及细胞生物学特性，应用免疫组化检测肝细胞标志ALB和CK18的表达，建立人胎儿MMSCs向类肝细胞分化的优化条件. 结果：未进行诱导的对照组细胞保持长梭型，形状因子4.5±1.0，面积较小，增生较快，呈典型成纤维细胞的漩涡状或火焰状生长，培养后期可见5~7个分支，无细胞变圆，双核细胞率小于0.1%，逐渐老化，颗粒增多. 组化染色未见表达ALB和CK18. 所有诱导组细胞在培养中细胞分支均减少，多为1~3个分支，未用基质的细胞仍保持长梭形生长，给予基质的诱导细胞部分形态由长变圆，形状因子下降，给予5氮胞苷（5azacitidine， AZA）预处理可抑制细胞过度增生，细胞形态由长梭型逐渐变短，PDGFBB预处理对细胞增生无明显抑制作用，细胞容易出现分支. 诱导各组组化染色显示，第21日时均有ALB和CK18阳性表达. 诱导2组～诱导5组的细胞转圆率、双核细胞比率及ALB，CK18阳性细胞比例均显著高于对照组及诱导1组(P&<0.05). 结论：在无血清培养条件下，按诱导4组的方案10 g/L Matrigel作基质，2.5 mmol/L AZA预处理10～12 h，HGF 10 μg/L＋FGF4 10 μg/L+HGM培养基可获得高比例的类肝细胞.
【关键词】 骨髓间充质干细胞；类肝细胞；细胞分化；诱导
0引言
骨髓间充质干细胞(MMSCs)是能分化为不同细胞和组织类型的多潜能细胞，是细胞移植的理想来源. 最近研究发现体内移植骨髓细胞可发育为肝细胞［1-5］. 因此，骨髓细胞有治疗急慢性肝功能衰竭的潜能. 我们采用体外培养的人胎儿MMSCs为研究对象，设计不同的诱导分化条件进行体外诱导，观察细胞诱导分化过程中形态结构变化及细胞生物学特性，应用免疫组化检测肝细胞标志的表达，以建立人胎儿MMSCs向类肝细胞诱导分化的优化条件.
1材料和方法
1.1材料
采用体外细胞分离培养方法从人胎儿骨髓获得MMSCs. 均签署知情同意书.
1.2方法
1.2.1分组对照组：无基质，MEM培养基，20 g/L FBS培养. 诱导1组：无基质，HGM培养基，20 g/L FBS培养. 诱导2组：无基质，HGM培养基，HGF 40 μg/L，FGF4 40 μg/L诱导. 诱导3组：10 g/L Matrigel作基质，HGM培养基，HGF 10 μg/L，FGF4 10 μg/L诱导. 诱导4组：10 g/L Matrigel作基质，HGM培养基，2.5 mmol/L AZA和20 g/L FBS预处理10～12 h，HGF 10 μg/L，FGF4 10 μg/L诱导. 诱导5组：10 g/L Matrigel作基质，HGM培养基，PDGFBB 10 μg/L，EGF 10 μg/L和20 g/L FBS预处理10～12 h，HGF 10 μg/L，FGF4 10 μg/L诱导.
1.2.2诱导过程对有基质的诱导组先予基质包被细胞爬片，选择第3~5代增生旺盛、活力良好的MMSCs，按（10～20）×103/cm2接种，按分组给予相应预处理10～12 h后，用0.01 mol/L PBS洗涤两次后，给予诱导，每2 d换液1次，于诱导的21 d收集细胞爬片，进行组化鉴定.
1.2.3倒置相差显微镜观察倒置相差显微镜观察并采用显微摄像记录诱导分化过程中细胞形态变化，计数21 d时细胞转圆率及双核细胞比例，并设培养的胎肝细胞为肝细胞对照.
1.2.4采用图像分析仪进行形态学参数分析选择培养到21 d时25个细胞，测量其平均面积(At)、最大直径(Dmax)及形状因子(Q).
1.2.5免疫组化染色检测诱导细胞中肝细胞标志蛋白ALB，CK18的表达检测按免疫组化试剂盒操作说明书进行. 设立未诱导的MMSCs为正常对照，胎肝切片及培养的胎肝细胞为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照. 光学显微镜下计数诱导前后阳性细胞数，选取3张染色玻片，每张爬片计数10个高倍视野(×100)，并计算表达中等强度阳性和强阳性的细胞占所计数细胞总数的百分比.
统计学处理： 数据均以x±s表示，多个样本比较采用H检验，各实验组与对照组及胎肝对照组两两比较采用Wilcoxon秩和检验.
2结果
2.1各组细胞在诱导过程中的形态变化对照组: 细胞保持长梭型，面积较小，增生较诱导各组慢，呈典型成纤维细胞的漩涡状或火焰状生长，无细胞变圆，双核细胞小于0.1%，培养后期可见5~7个分支，逐渐老化，颗粒增多(Fig 1).
诱导1组: 给予含20 g/L FBS的HGM培养基诱导细胞，与对照组比较，细胞仍保持长梭型，面积较小，增生较慢，但在培养后期，细胞分支较少，保持较好的活力，颗粒较少. 无细胞变圆，双核细胞小于0.1%(Fig 2).
诱导2组: 未予Matrigel作基质，在诱导1组的基础上，添加较高浓度的细胞因子HGF和FGF4，可使细胞保持良好活力，但细胞分支仍较多，多为1~3个分支，逐步出现较多近圆形细胞(Fig 3).A: 7 d; B: 21 d.
诱导3组: 添加10 g/L Matrigel包被爬片，同时将细胞因子浓度降至10 μg/L进行诱导，细胞在培养中分支较少，多为1~3个分支，细胞部分形态逐渐变成多角形、三角形、类圆形等(Fig 4).
诱导4组: 给予AZA预处理可抑制细胞过度增生，12 h后细胞肿胀，部分细胞漂浮死亡，存活的细胞部分形态由长梭型逐渐变短，形态变化最显著(Fig 5).
诱导5组: PDGFBB预处理后无细胞死亡，细胞容易出现更多分支，而后在诱导中细胞分支逐渐减少，对细胞增生无明显抑制作用，诱导后期也会出现较多类圆形细胞(Fig 6).
2.2诱导各组细胞的形态学分析选择各组培养21 d时25个细胞，对其形态学参数进行图像分析(Tab 1)，与对照组比较，经诱导后细胞面积、直径均显著变化(P&<0.01)，诱导1组和3组细胞形状因子与未诱导相近，仍呈长梭型为主，而诱导2组、诱导4组和诱导5组细胞形状因子下降(P&<0.01)，诱导第4组与胎肝细胞接近.表1诱导各组细胞图像分析结果（略）
2.3各组细胞转圆率和双核细胞率比较于培养21 d时，在100倍视野选择5个视野，每个视野计数100个细胞中多角形、三角形、类圆形等较接近肝细胞形态的细胞百分率为细胞转圆率［对照组，诱导1组～诱导5组分别为0%，0.4%，(45±5)%，(28±7)%，(45±5)%和(40±5)%，诱导2组～诱导5组均显著高于对照组及诱导1组，P&<0.013］，同时计数双核细胞百分率［对照组，诱导1组～诱导5组分别为&<0.1%，&<0.1%，(2.4±0.5)%，(1.4±0.5)%，(6.0±0.8)%和(3.5±0.5)%，诱导2组～诱导5组均显著高于对照组及诱导1组，P&<0.013］.
3讨论
通过设计不同诱导方案对MMSCs进行诱导，结果发现HGM培养基，HGF，FGF4，Matrigel和AZA都在MMSCs向类肝细胞分化过程中起作用，仅当几种因素同时存在时，MMSCs可较好地向类肝细胞分化，从形态变化和细胞表达肝细胞特异蛋白都得以证实.
常用的体外诱导方法是向体外培养的成体干细胞中加入诱导因子. 诱导因子包括各种能影响细胞分化的物质，如血清、糖分、维生素、O2以及各种蛋白因子等. 本实验中加入较高浓度的HGF和FGF4可诱导MMSCs向类肝细胞分化，与Oh等［6］报道的高浓度HGF体外诱导成年鼠骨髓细胞分化为肝细胞结果相似. Schwartz等［4］研究发现只有FGF4和HGF促进肝细胞分化. FGF4单用可诱导肝细胞分化. 用HGF处理的细胞分化程度更高. 与FGF4在原始内胚层发育及在内胚层特化［7］中起重要作用和HGF诱导增生不活跃肝细胞分化［6］是一致的.
以Matrigel作基质的各诱导组中显示MMSCs能较好的向类肝细胞分化. 影响肝细胞分化的其他信号包括细胞外基质(ECM)来源的信号［8］. 在Matrigel上的培养诱导了向表达肝细胞标志细胞的完全分化，因为Matrigel包含了ECM成分的混合物.
HGM培养基包含烟酰胺(NAA)，地塞米松，胰岛素，运铁蛋白，亚西酸钠，脯氨酸，微量元素(锌，锰，铜)等对原代肝细胞增殖、存活及胆汁淤积鼠来源的骨髓细胞在其血清存在下的分化有影响［9］. Miyazaki等［10］用HGM作为基础培养基，可诱导骨髓细胞向肝细胞样细胞克隆分化且表达终末分化标志色氨酸2，3脱氧酶(tryptophan2，3dioxygenase，TO)和酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)，而在DF培养基培养中从未检测到，且HGM中克隆的数量和大小远远大于DF培养基，提示HGM更适于从骨髓诱导肝细胞样细胞.
分化需要细胞周期停滞，用AZA预处理可抑制细胞生长，是横向分化所必不可少的. AZA预处理诱导组细胞转圆率及双核细胞率，ALB阳性及CK18阳性细胞率是各诱导组中最高的. AZA通过修饰甲基化作用而促进细胞分化［11］. 这种试剂通过抑制甲基转移酶而诱导沉默基因表达并引起低甲基化.
PDGF预处理并不能抑制MMSCs生长，对促进MMSCs向类肝细胞分化作用不明显.
需要进一步研究的是HGF，FGF4，AZA及Matrigel的最适宜诱导MMSCs向类肝细胞分化的浓度和诱导时间.
【
参考文献
】［1］ Theise ND， Badve S， Saxena R， et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiationinduced myeloablation ［J］. Hepatology， 2000;31(1):235-240.
［2］ Theise ND， Nimmakayalu M， Gardner R， et al. Liver from bone marrow in humans ［J］. Hepatology， 2000;32 (1):11-16.
［3］ Alison MR， Poulsom R， Jeffery R， et al. Hepatocytes from nonhepatic adult stem cells ［J］. Nature， 2000;406(6793):257.
［4］ Schwartz RE， Reyes M， Koodie L， et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocytelike cells ［J］. J Clin Invest， 2002;109(10):1291-1302.
［5］ Lagasse E， Connors H， AlDhalimy M， et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo ［J］. Nat Med，2000;6(11):1229-1234.
［6］ Oh SH， Miyazaki M， Kouchi H， et al. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2000;279(2):500-504.
［7］ Wells JM， Melton DA. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers ［J］. Development， 2000;127(8):1563-1572.
［8］ Sanchez A， Alvarez AM， Pagan R， et al. Fibronectin regulates morphology， cell organization and gene expression of rat fetal hepatocytes in primary culture ［J］. J Hepatol， 2000;32(2):242-250.
［9］ Avital I， Inderbitzin D， Aoki T， et al. Isolation， characterization， and transplantation of bone marrowderived hepatocyte stem cells ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2001;288(1):156-164.
［10］ Miyazaki M， Akiyama I， Sakaguchi M， et al. Improved conditions to induce hepatocytes from rat bone marrow cells in culture ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2002;298(1):24-30.
［11］ Kohyama J， Abe H， Shimazaki T， et al. Brain from bone: Efficient "metadifferentiation" of marrow stromaderived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent ［J］. Differentiation， 2001;68(45):235-244.