作者：李莹，药立波，王立峰，韩炯，韩月恒，刘新平，林树新，俞强
【关键词】 胃肿瘤
【Abstract】 AIM: To explore the inductive effects of the resveratrol from Rhizoma polygoni Cuspidati on the cell cycles， growth and apoptosis of the gastric cancer cells HGC27. METHODS: MTT method and soft agar assay were performed to observe the effects of the resveratrol on the cell growth. AnnxinV && PI staining assay and FCM assay were used to examine the inductive effects of resveratrol on the cell cycles and apoptosis. RESULTS: MTT results manifested that the cell survival rate decreased significantly and in dose dependent manner 24 h after HGC27 was incubated with 0.5 mmol/L resveratrol (P&<0.01 vs control). Soft agar assay results indicated that HGC27 could not form cell colony when it was incubated with 0.5 mmol/L resveratrol. AnnxinV && PI staining assay and FCM assay showed that resveratrol could inhibit the HGC27 to G1 phase and induce cells to apoptosis (8.39%). CONCLUSION: Resveratrol can inhibit the growth of HGC27 and induce the cells to apoptosis.
【Keywords】 resveratrol; apoptosis; stomach neoplasm; tumor cells; HGC27
【摘要】 目的：观察虎仗提取物白藜芦醇对胃癌细胞HGC27细胞周期和增殖的影响及凋亡诱导作用. 方法: 采用MTT法和软琼脂集落形成实验观察白藜芦醇对细胞增殖的影响， AnnxinV && PI染色及流式细胞仪检测观察白藜芦醇对细胞周期的影响及诱导凋亡的作用. 结果：MTT实验发现白藜芦醇作用HGC27细胞24 h后，细胞存活率显著下降（P&<0.01）并呈剂量依赖性，软琼脂集落形成实验发现HGC27细胞在0.5 mmol/L白藜芦醇作用下无细胞集落的形成， AnnxinV && PI染色及流式细胞仪检测发现白藜芦醇可引起HGC27阻滞于G1期，并可诱导HGC27发生凋亡(8.39%). 结论：白藜芦醇可抑制胃癌细胞HGC27增殖并可诱导细胞发生凋亡.
【关键词】 白藜芦醇；凋亡；胃肿瘤；肿瘤细胞；HGC27
0引言
从天然生物中寻找低毒，高效的抗肿瘤药物已成为近年的研究热点［1］. 白藜芦醇是植物在遇到真菌感染、紫外线照射等恶劣环境下自身分泌的一种天然抗毒素，广泛存在于百合科、蓼科、豆科等21个科31个属的72种植物中. 研究发现白藜芦醇不仅具有调节脂质代谢、抑制血小板聚集、保护心血管等多方面的作用，而且对乳腺癌、前列腺癌和白血病等一些肿瘤细胞系的生长具有显著抑制作用［2-5］. 我们采用软琼脂集落形成实验、MTT实验、AnnexinV&&PI细胞染色实验、流式细胞仪检测方法对白藜芦醇抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡及对细胞周期的影响进行研究如下.
1材料和方法
1.1材料
人胃癌细胞株HGC27购自中国科学院上海细胞研究所细胞库； RPMI 1640培养基（Gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程公司）；MTT（华美公司Sigma分装）； DMSO（Sigma公司）；琼脂粉（北京百灵克公司Sigma分装）；NUAIRE CO2细胞培养箱（autoFlow公司）；FACS Calibur流式细胞仪（BD公司）. 白藜芦醇由西安市天行健生物制品有限公司提供，中药虎杖中提取，纯度&>95%，用DMSO配制成100 mmol/L溶液，分装，-20℃储存. 细胞采用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃含50 mL/L CO2的细胞培养箱中培养. 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA消化、传代.
1.2方法
1.2.1MTT法调整单细胞密度1×107/L，接种于96孔培养皿内，24 h后试验组分别加入含有不同浓度的白藜芦醇(0.1~1.0 mmol/L)，对照组细胞加入同体积的药物溶剂，空白对照孔不加细胞，作本底对照调零. 实验做6个平行复孔. 细胞分别培养24， 48和72 h后，吸尽旧培养液，加入含5 g/L MTT的培养基150 μL，继续培养4 h，吸尽培养液 ，加入二甲基亚砜，振荡至紫色结晶完全溶解，用酶标仪测定每孔的A570 nm值(选择波长570 nm，参考波长620 nm). 计算瘤细胞存活率=(实验组A570 nm值/对照组A570 nm值)×100%，绘制药物浓度存活率曲线.
1.2.2Soft agar assay配制底层5 g/L软琼脂，顶层3 g/L软琼脂的生长体系，接种7×1010/L个细胞于顶层软琼脂，实验组同时加入白藜芦醇(使其终浓度为0.5 mmol/L)，每个样品做3个复孔，CO2培养箱中培养2 wk后显微镜下观察集落形成情况并计数. 集落计数方法：在镜下随机计数10个视野中的集落数（集落确定标准：4个细胞以上），取其平均数作比较.
1.2.3检测细胞周期和凋亡调整单细胞密度0.5×109/L接种于培养皿中，24 h后加白藜芦醇(0.5 mmol/L)共同孵育，对照组加入同体积的DMSO. 药物作用24 h后收集细胞，1500 r/min离心5 min，吸弃上清，PBS洗1次，加无水乙醇（终体积分数为70%），置-20℃固定保存. 检测时用PBS洗细胞2次， PI暗处染色20 min后上流式细胞仪检测. Cell Quest软件获取单个细胞20 000个，用ModFit LT软件分析细胞周期及凋亡峰. 实验重复3次. 调整单细胞密度0.5×109/L，接种于培养皿内，培养24 h后实验组加白藜芦醇(0.5 mmol/L)，对照组加相同体积的DMSO，作用24 h后收集细胞，PI && AnnexinV双染细胞（AnnexinV是一种Ca2+依赖性结合蛋白，能与翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合），流式细胞仪检测凋亡细胞和死亡细胞. 实验重复3次.
统计学处理：结果以x±s表示， SPSS 10.0统计软件进行分析，组间差异比较采用方差分析，两两比较用Dunnett法及t检验，方差不齐时采用秩和检验.
2.1白藜芦醇抑制胃癌细胞HGC27增殖HGC27细胞在白藜芦醇的作用下存活率显著下降，并呈浓度依赖性(n=6， Fig 1). 白藜芦醇作用于HGC27细胞的IC50为0.508 mmol/L. HGC27细胞在软琼脂中培养2 wk后可形成多个、比较大的细胞集落(对照组细胞集落数为13±3)，选取0.5 mmol/L白藜芦醇作用细胞2 wk后，则未见细胞集落的形成(Fig 2). 实验结果表明：白藜芦醇可以抑制HCG27细胞非锚着依赖性生长. 软琼脂集落形成实验和MTT实验表明白藜芦醇可以抑制胃癌细胞HGC27的生长.
2.2白藜芦醇诱导胃癌细胞HGC7凋亡及G1期阻滞HGC27细胞在0.5 mmol/L白藜芦醇作用下G0G1期升高，S期下降，并出现了凋亡峰(Fig 3). 0.5 mmol/L白藜芦醇作用于HGC27细胞24 h后，用AnnexinV && PI 进行染色，流式细胞仪进行分析发现，早期凋亡细胞(4.1±0.8)%和晚期凋亡细胞及死亡细胞的总和(42.7±9.7)%明显多于对照组早期凋亡细胞(1.9±0.4)%和晚期凋亡细胞及死亡细胞的总和(2.3±0.3)% (P&<0.01 vs control group， n=3). 上述两实验结果表明白藜芦醇不仅可引起HGC27细胞周期阻滞于G1期而且可以诱导细胞发生凋亡.
3讨论
白藜芦醇显著抑制多种肿瘤的生长并诱导肿瘤细胞发生凋亡， 如鼠肝细胞癌、人肝母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、口腔鳞癌、白血病、恶性黑色素瘤及卵巢癌等［2-5］. 我们观察到白藜芦醇不仅对胃癌细胞HGC27的生长具有显著的抑制作用而且可以诱导细胞发生凋亡，为白藜芦醇抗肿瘤作用的研究提供了佐证. 虽然白藜芦醇对肿瘤的生长具有抑制作用，但是具体的作用机制并不明确. 我们发现白藜芦醇可引起胃癌细胞HGC27发生G1期阻滞，这可能是白藜芦醇抑制HGC27增殖的原因. 但白藜芦醇对不同细胞系细胞周期的影响是不一致的，白藜芦醇可引起乳腺癌细胞系和表皮癌细胞系发生G0/G1→S期阻滞［2，3］，但是却引起人结肠癌细胞系、白血病细胞系和肺上皮癌细胞系发生S→G2/M期阻滞［4］，而在人的淋巴瘤细胞，白藜芦醇在低浓度(30~60 mmol/L)时可诱导细胞发生S期阻滞，浓度过高反而无此活性，同时认为这一阻断过程是可逆的［5］. 因此，白藜芦醇对不同肿瘤细胞系细胞周期的调控方式应该是不一致的，诱导不同肿瘤细胞系凋亡的机制亦是不一致的. 其确切的作用机制还有待我们深入的研究.
参考文献
［1］ 李永琦， 许才绂， 黄裕新， 等. 复方中药CCMAT13 抗胃癌的作用机制［J］. 第四军医大学学报，2001; 22(9):831-834.
Li YQ， Xu CF， Huang YX， et al. Antitumor effects and mechanism of a compound Chinese traditional medicine (CCMAT13) on xenografted human gastric cancer［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2001; 22(9)：831-834.
［2］ Ahmad N， Adhami VM， Afaq F， et al. Resveratrol causes WAF1/p21mediated G(1)phase arrest of cell cycle and induction of apoptosis in human epidermoid carcinoma A431 cells［J］. Clin Cancer Res， 2001;7(5):1466-1473.
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