【关键词】 端粒酶
【Abstract 】 AIM: To observe the inhibiting effects of SBHL on the growth of HeLa cells and to investigate the inhibiting mechanisms. METHODS: The proliferation of HeLa cells was observed by MTT assay and the changes of the cell cycle of HeLa cells treated with SBHL were analyzed by flow cytometry. The expressions of hTRT gene were detected by immunohistochemistry techniques and the differentiation of HeLa cells was observed by WrightGiemsa staining. RESULTS: The proliferation of HeLa cells was inhibited at 0.1-20.0 mg/L SBHL. The inhibiting effect increased gradually following the increase of concentration of SBHL. The percentage of HeLa cells in S phase decreased and the percentage of cells in G1 phase increased after the cells were treated by SBHL， indicating that SBHL arrested HeLa cells in G1 phase and thus the synthesis of DNA was inhibited. After treatment by SBHL， the expressions of hTRT gene of HeLa cells decreased obviously. Differentiated HeLa cells wwere found after treatment by SBHL. CONCLUSION: ① The growth of HeLa cells is inhibited obviously by SBHL and the inhibiting effect is dependent on the concentration of SBHL. ② The expressions of hTRT gene are downregulated， the telomerase activity is inhibited and the growth of HeLa cell is inhibited.
【Keywords】 SBHL; HeLa cell; telomerase; flow cytometry; cell cycle; cell differentiation
【摘要】 目的：观察SBHL对HeLa细胞生长的抑制作用，并探讨其作用机制. 方法：用MTT比色法观察不同浓度SBHL对HeLa细胞增殖的影响；用流式细胞术对细胞周期进行分析；用免疫组化方法观察SBHL对HeLa细胞人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase， hTRT)基因表达的影响. 用瑞氏姬姆萨染色法观察SBHL对HeLa细胞形态的影响. 结果：0.1~20.0 mg/L SBHL对HeLa细胞增殖有明显的抑制作用，这种抑制作用随SBHL浓度的增加而增加；流式细胞术对细胞周期进行分析的结果显示，随着SBHL浓度的增加，S期细胞含量逐渐降低，G1期细胞含量逐渐增加，SBHL将细胞阻滞于G1期，抑制DNA合成. SBHL处理的HeLa细胞与对照组相比， hTRT基因的表达明显降低；瑞氏姬姆萨染色结果表明SBHL可使HeLa细胞向良性分化. 结论：SBHL明显抑制HeLa细胞生长呈浓度依赖性. SBHL下调HeLa细胞hTRT基因的表达，抑制端粒酶活性.
【关键词】 SBHL；HeLa细胞；端粒酶；流式细胞术；细胞周期；细胞分化
0引言
龙葵为茄科茄属植物，全草入药. 龙葵具有清热解毒、化痰止咳等作用. 药理实验表明有抗菌、消炎、抗肿瘤等作用［1］. SBHL是从龙葵浓缩果汁中提取出的一种游离的生物碱盐酸盐，在此盐分子上增加活性基团，保持其原有生物学活性基础上，使其产生新的高效活性. Putalun等［2］对龙葵的成分、分离方法、抗凝血及抗肿瘤作用进行了研究. 龙葵总生物碱或其中成分有抑制肿瘤作用，而由龙葵总生物碱转化而成的有效成分SBHL，其抗肿瘤活性及抗肿瘤作用机制无报道. 我们观察了不同浓度SBHL对HeLa细胞生长的抑制作用，并探讨了SBHL对HeLa细胞生长抑制作用的机制.
1材料和方法
1.1材料
HeLa细胞由长春肿瘤研究所提供; SBHL由北华大学医学院刘良教授提供，用二蒸水配置成贮液. 用RPMI 1640培养液配制成终浓度为0.01， 0.1， 1.0， 10.0和20.0 mg/L. RPMI 1640， 胰蛋白酶和胎牛血清为Gibco公司产品；MTT， PI和DMSO均为Sigma公司产品. DAB显色试剂盒和通用型SP试剂盒和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase， hTRT)检测试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司.
1.2方法
用胰酶消化处于对数生长期细胞，接种于96孔培养板中，以不同浓度梯度SBHL作用于HeLa细胞，每个浓度3个孔，同时设不加SBHL对照孔，培养液空白孔，对照孔各3孔. 培养5 d，每日取1板，加入 MTT(1 g/L)，继续培养4 h后，移去上清并用吸水纸吸干培养液，再加入DMSO，振荡至结晶完全溶解后，用酶标仪测定A490 nm. 将处于对数生长期的HeLa细胞加入25 mL培养瓶中，当80%～90%细胞汇合时，加SBHL作用72 h，用胰酶消化收集细胞， PBS洗2次， 4℃固定24 h后，加入RNase，37℃水浴消化1 h，再加入PI，避光4℃染色30 min 200目网筛滤过，上流式细胞仪检测HeLa细胞周期变化. 将1.0 mg/L SBHL加入对数生长期细胞培养72 h，消化成单个细胞，将其涂在玻片上，加丙酮固定. 按试剂盒说明进行操作. 用SP免疫组化法分别检测HeLa细胞hTRT基因的表达，图片置于摄像显微镜下，选取观察部位. 随机选取3~5个视野，在图像分析仪下测定灰度值，灰度值用Y=0.299R+0.587G+0.114B计算. 收集对数生长期细胞，用胰酶消化，制成细胞悬液，加SBHL终浓度为1 mg/L，培养72 h后取出盖片，乙醇固定. 加瑞氏姬姆萨染色，在显微镜下观察细胞形态.
2结果
2.1MTT比色法0.01 mg/L SBHL对HeLa细胞生长抑制作用与对照组相似(P&>0.05)，0.1～20.0 mg/L SBHL处理的HeLa细胞组与对照组相比均有显著性差异（P&<0.05），说明0.1～20.0 mg/L SBHL对HeLa细胞的增殖具有明显抑制作用，而且随着SBHL浓度的增加，抑制作用增强(Tab 1， Fig 1).表1SBHL对HeLa细胞的生长抑制作用（略）
2.2流式细胞术经SBHL作用后HeLa细胞G1期增加，S期减少，说明SBHL可以将细胞阻滞于G1期，抑制DNA合成(Tab 2).表2SBHL对HeLa细胞周期的影响（略）
2.3hTRT基因表达未经SBHL处理的HeLa细胞核染成棕黄色阳性(Fig 2A). 10.0~20.0 mg/L
SBHL处理的HeLa细胞72 h后，细胞核被染成棕黄色的HeLa细胞明显减少，大部分细胞核染成蓝色，呈阴性(Fig 2B)，表明hTRT基因表达受到明显抑制.
2.4HeLa细胞形态经瑞氏姬姆萨染色，光镜观察可见未经SBHL处理的HeLa细胞排列密集，细胞呈圆形，大小不一，瘤巨细胞多见；细胞核质比例大，核大、核仁多;而SBHL处理组细胞随药物浓度增大细胞排列稀疏，呈长梭形或多边形，胞质伸出长的不规则突起，相互联接成网状结构，细胞大小趋向一致，瘤巨细胞少见；细胞核、质比例增大，核小，且核仁减少，染色变浅(Fig 3A，B).
3讨论
SBHL是从龙葵中提取出的龙葵总生物碱，经生物转化后的主要活性成分，其抑制肿瘤作用研究尚未见报道. 我们观察到0.1~20.0 mg/L SBHL对HeLa细胞具有明显的抑制作用. 对HeLa细胞周期有明显的影响，G1期细胞增加，S期细胞减少，说明SBHL可以将细胞阻滞于G1期，抑制DNA合成.
SBHL可诱导HeLa细胞形态趋向良性分化，部分恢复正常细胞形态，细胞排列稀疏，呈长梭形或多边形，胞质伸出长的不规则突起，相互联接成网状结构，细胞大小趋向一致，瘤巨细胞少见；核小，且核仁减少，染色变浅. 细胞功能的体现也是肿瘤细胞分化的标志. 从功能方面来看，细胞增殖、细胞分裂和集落形成均显示HeLa细胞生长明显受抑制. 同时，流式细胞术分析DNA周期也发现细胞被阻止于G1期，S期细胞百分率下降. 端粒酶是一种依赖RNA的逆转录酶，能够延长染色体末端的端粒长度. 正是端粒酶的活化通过对端粒长度的维持 使细胞得以永生化，而永生化也正是细胞恶变的必经步骤［3］. 端粒酶在正常人体细胞中并不表达，在多种肿瘤中均可检出端粒酶活性［4，5］. 端粒酶催化亚单位即hTRT是细胞永生化及恶性肿瘤发生过程中的端粒酶活化的主要限速步骤，hTRT基因表达可以反映端粒酶活性，与端粒酶活性具有平行关系. 我们发现未用SBHL处理的HeLa细胞hTRT基因高度表达，用SBHL处理后的HeLa细胞hTRT基因表达明显降低. 因此，SBHL可能通过下调hTRT基因表达，抑制端粒酶活性，使细胞分裂中端粒逐渐缩短，最终使细胞死亡. 总之，SBHL主要通过下调hTRT基因的表达，抑制HeLa细胞的生长.
参考文献
［1］ 谢启梅，谢军荣. 龙葵在肿瘤治疗中的应用［J］. 江西中医药，1996; 27(2):52-53.
Xie QM， Xie JR. The use of solamargine treated on tumors［J］. Jiangxi Chin Drug， 1996;27(2):52-53.
［2］ Putalun W， Tanaka H. Survey of solasodinetyRe glycoalkaloids by western blotting and ELISA using antisolamargine monoclonal antibody［J］. Biol Pharm Bull， 2000;23（1）：72-75.
［3］ Huschtscha LI， Bartier WA， Andersson CE， et al. Characteristics of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vitro［J］. Br J Cancer， 1996;73:54-60.
［4］ Mandal M， Maggrrar SB， Sharma N， et al. Bcl2 prevent CD95 (Fas/APOI) induced degradatron of lamin B and Ply(Aopribose) polymerase and restores the NFKB signaling Pathway［J］. J Biol Chem， 1996;271：30354-30359.
［5］ Li H， Caoy， Berndtmc， et al. Molecular interactions between telomerase and the tumor suppressor protein p53 in vitro ［J］. Oncogene， 1999; 18(48): 6785-6794.