关于改进检测人类性染色质的方法

【关键词】 性染色质
　　【Abstract】 AIM: To improve the detection method of human sex chromatin. METHODS: Human buccal mucosal cells were used as materials， the operation of centrifugal dropping slide was improved and the concentration levels were changed in three dyes， Thionin， Giemsa and Aceticgentian violet (AGV). Cover dyed method was employed in staining. RESULTS: Equalized Barr Body Frequency (BBF) was obtained in the samples that had been dyed respectively by Thionin， Giemsa and Aceticgentian violet (20.3±1.4)%， (19.5±1.5)% and (20.0±1.0)% respectively. CONCLUSION: The application of the improved detecting method of human sex chromatin enables us to detect sex chromatin immaculately.
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　　【Keywords】 sex chromatin; dye; detection method
　　【摘要】 目的：改进检测人类性染色质的方法. 方法：以人类口腔黏膜细胞为材料，改进离心滴片法操作流程，改变三种染液硫堇、吉姆萨、冰醋酸龙胆紫的浓度，用扣染法进行染色. 结果：改进后的检测效果好，三种染液硫堇、吉姆萨、冰醋酸龙胆紫所染出的性染色质出现率均等，分别为(20.3±1.4)%， (19.5±1.5)%， (20.0±1.0)%. 结论：应用改进的人类性染色质检测方法，可以准确检出性染色质.
　　【关键词】 性染色质；染液；检测方法
　　0引言
　　检测性染色质失败的原因，除了主观上因素外，检测本身也存在一些问题，例如细胞没有分散开而出现的重叠现象，或是染色过深以至性染色质与核内其他物质不易区分，影响镜检效果. 根据以上情况，对人类性染色质检测做了三个方面的改进：①制片方法；②染液的最佳浓度；③染色方法.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　取年龄段在21~22岁女性大学生18人，取其口腔黏膜细胞做实验材料. 在原有的离心滴片法的基础上，增加解离过程，以松软细胞，利于滴片和染色. 先解离后固定，解离和固定都在离心管中进行，用以加强解离的程度和防止细胞损失. 受检者漱口后，用牙签轻轻刮取两侧颊部内侧的黏膜，弃去第1次刮取到的黏膜细胞，在同一部位连续刮取数次，将刮取的细胞涮入装有生理盐水3 mL的刻度离心管中，以1000 r/min离心10 min，弃去上清液. 加入1 mol/L盐酸3 mL，用乳头吸管将细胞团轻轻打散，制成悬液，37℃解离20 min，以1000 r/min离心10 min，弃去上清液. 加入新配制的卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸，V∶V＝3∶1）3 mL，用乳头吸管将细胞团轻轻打散，制成悬液，室温下固定10 min，再次打散细胞团后，继续固定20 min. 离心前将细胞打散，以1000 rmin离心10 min，弃去上清液，根据细胞的多少加0.1~0.2 mL新配制的卡诺固定液，将细胞打散，制成悬液. 用乳头吸管取细胞悬液，滴于冰水浸过的载玻片上，自然晾干后，染色.
　　1.2方法
　　采用吉姆萨（Giemsa）、 硫堇（Thionin）和冰醋酸龙胆紫（AGV）三种作为人类性染色质检测染色的染液，改进后的染液浓度均低于原先浓度. 吉姆萨染液以吉姆萨原液与pH为6.8的磷酸缓冲液体积比为1∶19配成；硫堇染液以硫堇母液与蒸馏水体积比为1∶3配成；冰醋酸龙胆紫染液以冰醋酸龙胆紫母液与蒸馏水体积比为1∶3配成. 人类性染色质检测常把染液滴到制备好的片子上进行染色，这种片子背景上常会残留染液杂质， 直接影响镜检，因此改进为扣染法染色. 性染色质位于核膜内面，着色较核内其他易染质深，轮廓清楚；大小约为1.0~1.5微米；形状多呈三角形或半圆形；形态相似但不依附于核膜内面的，虽很可能是性染色质，但为避免与核内其他易染质混淆，故均不计入. 凡是核固缩皱褶变小、核膜缺损、染色过深、染色质颗粒粗大成团或有杂质附着、胞核重叠等均不作为可数细胞计数.
　　统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS 11.0软件进行统计学描述. 所用统计方法为t检验和方差分析.
　　2结果
　　改进后的离心滴片法所制的玻片上细胞数量多，细胞较少重叠，解离程度好，在高倍镜下观察，细胞核与细胞质区分明显，核质均匀，核内及周围较少杂质分布，可计数细胞多，易镜检到标准形态的性染色质. 按照原有方法染色，不能得到理想的效果，不是染色过深，就是细胞核与细胞质对比不明显，可能是由于染液浓度过高或是染色时间不适所造成. 因此在改进染液浓度的基础上选择出最佳染色时间，制出的片子中细胞核与细胞质着色对比明显，核质着色均匀，性染色质形态标准，着色深，易镜检. 改进后的三种染液的最佳染色时间（min），硫堇染色时间由原来的30 min改进为15~17 min；吉姆萨染色时间由原来的10 min改进为5~7 min；冰醋酸龙胆紫染色时间由原来的1~2 min改进为8~12 min. 改进后的冰醋酸龙胆紫染液的染色时间比改进前长，解决了染色时间过短，易染过，使核深染而不易镜检的缺点. 取女性大学生的口腔黏膜细胞做检测材料，用改进后的三种染液对所制玻片染色后，每个玻片镜检约1000个的口腔黏膜细胞，统计性染色质出现率（Barr body frequency， BBF）.

实验结果表明改进后的三种染液之间的差异并不是很大（Tab 1），但三种染液各具特色: ①硫堇染液配制和保存简便，但染液易受外界环境的影响，易因失水（晾干）后结晶，其染色效果好，细胞核与细胞质对比明显，利于观察（Fig 1），用扣染法染色后用蒸馏水冲洗制片，标本可以短时间放置而不出现结晶. ②吉姆萨染色的细胞背景染料杂质少，细胞轮廓清楚，细胞质均匀，性染色质形态清晰（Fig 2），但细胞质与细胞核的对比不如硫堇染液与冰醋酸龙胆紫染液明显（Fig 3）. ③冰醋酸龙胆紫染液配制和保存简便，且比较稳定，不会因光照和氧气等影响而发生变化，以致产生沉淀，显色效果好，细胞核与细胞质对比明显，利于镜检，且在染色过程中，若不慎染色过深，可用少量950 mL/L乙醇洗去染液. 用改进后的染色方法染出的片子背景清洁，染液中的杂质很少能沉淀到片子上，染色时间到后，用蒸馏水冲洗玻片，这样可避免滴片法染色后需用吸水纸吸取过多的染液，易将吸水纸上的纸纤维留于玻片，影响镜检. 此外，用扣染法染色，如果镜检发现细胞着色浅，还可以用扣染法继续染色. 总细胞数、性染色质数和BBF在三种染液染色间无显著差异(P&>0.05， Tab 1). 改进后的方法其硫堇、吉姆萨和冰醋酸龙胆紫染液对口腔黏膜细胞染色呈BBF与中国性成熟期正常女性涂片法BBF间有显著差异(P&<0.05).表1改进的三种染液对女大学生口腔黏膜细胞染色后BBF的比较（略）
　　3讨论
　　本实验所得出的口腔黏膜细胞的BBF与孙中芙等［1］所做的中国汉族正常女性的BBF及性成熟期正常女性的BBF的平均值相符，改进后的三种染液对Fig 3Detection of sex chromatin by AGV stain×400口腔黏膜细胞染色呈BBF明显高于赵小萍等［2］的结果，其中冰醋酸龙胆紫染液比后者高出9.64%，硫堇染液比后者高出7.69%，说明改进方法对人类性染色质的检测更明显有效. 改进后的冰醋酸龙胆紫染液的染色时间适中，更有利于控制掌握；改进后的硫堇和吉姆萨染液的染色效果明显，性染色质清晰，且细胞背景染料杂质少，不易结晶的优点.
　　改进前的整个制片时间（包括染色）大约在24~69 min，而改进后的整个制片时间（包括染色）比改进前长，大约在88~97 min，这主要是对人类性染色质的检测采用改进的离心滴片法制片的结果，其操作过程至少80 min. 虽然改进后的整个实验过程时间略长，操作较原有的直接涂片法复杂，但直接涂片法致使细胞不能完全分开，有重叠细胞团，导致镜检和统计困难. 改进后的离心滴片法，增加了解离过程，促进细胞松软，能够使细胞充分分散，不重叠；固定过程在离心管中进行，减少了由于固定液挥发而导致细胞结构的破坏；改进染液浓度和染色方法，使染色时间易于控制，减少染液杂质留于玻片，使细胞核与质对比明显，易分辨统计.
　　检测方法的改进，在不同程度解决了原来染液染色时间短、易深染（冰醋酸龙胆紫染液）、易结晶破坏细胞形态（硫堇染液）、细胞质与细胞核着色对比不明显(吉姆萨染液)的缺陷，使染色时间及染色程度有利于掌握控制. 采用扣染法染色，解决了染液杂质易沉淀在标本上，污染视野，减少可计数细胞数量等缺点，更利于镜检与统计.
　　改进的检测方法可以准确检出性染色质，相对于荧光原位杂交法（FISH）［3，4］而经济实用易于操作，对于筛选人类性别畸形，特别是克氏综合征（Klinefelter syndrome）［5］提供了一种快速可靠的检测方法.
　　

参考文献

　　［1］ 孙中芙，王彤. 中国人汉族正常女性的X染色质出现率［J］. 中国优生与遗传杂志，1999；7（1）：38-39.
　　Sun ZF， Wang T. The normal female women of Chinese the Han nationality of BBF［J］. J Birth Health Heredity， 1999; 7(1):38-39.
　　［2］ 赵小萍，李忠孝. 在X染色质标本制作中三种不同材料和染液的比较分析［J］. 泸州医学院学报，1995；18（3）：182-184.
　　Zhao XP， Li ZX. Compared and analyzed of three different materials and dyes for execution X chromatin［J］. J Luzhou Med Coll， 1995;18(3):182-184.
　　［3］ Mark HF， Mills DR， Kim E， et al. Fluorescent in situ hybridization assessment of chromosome copy number in buccal mucosal cells［J］. Cytobios， 1996; 87(349):117-126.
　　［4］ Schad CR， Kuffel DG， Wyatt WA， et al. Application of fluorescent in situ hybridization with X and Y chromosome specific probes to buccal smear analysis［J］. Am J Med Genet， 1996; 66(2):187-192.
　　［5］ Kamischke A， Baumgardt A， Horst J， et al. Clinical and diagnostic features of patients with suspected Klinefelter syndrome［J］. J Androl， 2003; 24(1): 41-48.