关于男性不育患者精浆NO的含量对生精细胞凋亡的影响

　　　　　　　　 作者：于爱莲，柳雅玲，张风雪，李亚鲁，赵英会

【关键词】 男性不育
　　【Abstract】 AIM: To explore the roles of nitric oxide (NO) content in apoptosis of spermatogenic cells in male infertile cases. METHODS: NO concentration was tested by nitric acid reductase in 80 male infertile cases and 62 normal fertile men. Apoptosis of spermatogenic cells was examined by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphophatebiotin nick end labeling (TUNEL) in 15 male infertile cases， 12 male infertile cases with level of NO over 135 μmol/L and 15 normal fertile men. The ultrastructure of apoptotic spermatogenic cells was observed by electron microscopy. RESULTS: The NO concentration in semen was (107.8±25.9) and (76.5±16.4) μmol/L in the 80 male infertile cases and the 62 normal fertile men respectively. There was significant difference between the two groups (P&<0.01). The NO concentration was (76.7±10.4) μmol/L and the apoptosis rate of spermatogenic cells was (3.8±1.3)% in 15 normal fertile men， while those of the 15 infertile cases were (112.7±14.3) μmol/L and (4.7±1.9)% respectively. The apoptosis rate of spermatogenic cells was (16.3±4.0)% in 12 male infertile cases with NO level over 135 μmol/L. The NO concentration and the apoptosis rate of spermatogenic cells in male infertile cases were higher than those of normal group (P&<0.05). The apoptosis rate of spermatogenic cells in male infertile cases with NO level over 135 μmol/L was significantly high than that in normal group (P&<0.05) and other male infertile cases (P&<0.01). Electron microscope showed that the spermatogenic cells had such changes as the concentration and increased electron density of the nuclear chromatin， the expansion and folding of the nuclear membrane， the decomposition of the nucleus， and the appearance of apoptotic bodies. CONCLUSION: Abnormal high levels of NO in semen result in the increased apoptosis of spermatogenic cells， which reduce fertility.
　　【Keywords】 nitric oxide; male infertile; spermatogenic cells; apoptosis
　　【摘要】 目的：探讨在男性不育中精浆NO含量对生精细胞凋亡的影响. 方法：应用硝酸还原酶法测定80例男性不育患者和62例正常有生育能力的健康男性（正常对照）精浆NO的含量；应用TdT介导的原位末端标记法检测15例男性不育患者、12例精浆NO的含量超过135 μmol/L的不育患者和15例正常健康男性的生精细胞凋亡情况；电镜观察不育患者生精细胞凋亡的超微结构变化. 结果：不育组与正常对照组精浆 NO含量分别为(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L，差异极显著（t=8.34，P&<0.01）；15例正常生育组精浆NO含量为(76.7±10.4) μmol/L，生精细胞凋亡率为(3.8±1.3)%；15例不育组NO含量为(112.7±14.3) μmol/L，生精细胞凋亡率为 (4.7±1.9)%；12例不育组精浆NO含量高(&>135 μmol/L)者的生精细胞凋亡率为（16.3±4.0）%. 不育组精浆NO含量和生精细胞的凋亡率均高于正常对照组（P&<0.05). 不育组精浆NO含量超过135 μmol/L者的生精细胞凋亡率与正常对照组比较两者差异极显著（P&<0.01）. 电镜观察发现，不育患者生精细胞出现核染色质浓缩、电子密度升高、核膜折叠、核裂解、形成凋亡小体等一系列变化. 结论：NO含量异常升高使生精细胞凋亡增加而降低生育能力.
　　【关键词】 一氧化氮; 男性不育; 生精细胞;凋亡
　　0引言
　　一氧化氮（NO）具有自由基化学性质和多种生物功能 ［1］. NOS(nitric oxide synthase)广泛存在于人类生殖系统各组织，参与男性生殖系统功能的调节，如精子的发生、成熟及精原细胞凋亡等. NO通过调节睾丸血供及激素分泌、影响精液质量，降低精子细胞的运动能力，影响生殖功能［2-4］. 关于男性不育患者NO含量与生精细胞凋亡的关系目前报道极少，我们检测80例男性不育患者精浆NO的含量，观察NO的含量与生精细胞凋亡的关系，旨在进一步探讨男性不育发生的机制.
　
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　199805/200303泰安市各医院及章丘市人民医院收治的男性不育患者80例，年龄24～41（平均29.3±3.1）岁，婚龄2～12（平均5）a. 育龄夫妇结婚2 a以上，性生活正常，双方均未采取任何避孕措施，无严重躯体性疾病；排除隐睾症、腮腺炎、内分泌系统疾病，无接触放射线等因素所致的不育；女方无明显不育因素. 正常男性生育组62例，身体健康，有正常生育史，无生殖道疾病，精液常规正常，年龄23～39（平均28.3±3.0）岁. 检测病例禁欲3~5 d，手淫法取精液于洁净容器中，置37℃恒温箱中待液化后进行检测.
　　1.2方法
　　1.2.1NO含量检测用硝酸还原酶特异性将NO3还原为NO2，通过显色深浅测其NO2浓度的高低，间接反映NO的水平. 操作过程:取待检精液0.1 mL，然后严格按照试剂盒说明书专人操作. 用分光光度计（上海第三分析仪器厂生产）于550 nm，0.5 cm光处，测定样品的吸光度A值，根据下列公式计算NO含量. NO（μmol/L）＝（测定管的A值-空白管的A值）/（标准管的A值-空白管的A值）×100 μmol/L×样品的稀释倍数. NO测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

　1.2.2生精细胞凋亡检测取液化的精液2 mL缓慢加入到底部已有2 mL 450 mL/L percoll液的试管中，2000 r/min，离心20 min，取精液与450 mL/L percoll分离液交界处的细胞层，加入等量的生理盐水混均，1500 r/min，离心10 min，弃上清，沉淀用生理盐水配成1∶5浓度的细胞悬液. 取细胞悬液一式两份各10 μL，一份涂在干净的玻片上（细胞形态观察用），另一份涂在有多聚赖氨酸的玻片上（TUNEL检测用），剩余细胞悬液放入戊二醛固定液中，用于电镜观察. 另取一张已制备好的细胞涂片进行HE染色，镜检. TdT介导的原位末端标记法检测凋亡细胞：按照试剂盒说明书专人操作. 细胞凋亡试剂盒购自南京建成生物工程研究所; 镜下凋亡细胞的核中有棕褐色颗粒，非凋亡细胞用苏木素染为蓝色.细胞体积缩小，致密染色质聚集，断裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小体. 取戊二醛固定的细胞，经磷酸缓冲液冲洗，饿酸固定，乙醇梯度脱水，用Epon812树脂浸透包埋，LKB型超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在透射电镜（JEM1200，日本）下观察.
　　统计学处理： 应用SPSS 10.0统计分析软件，进行方差分析和t检验.
　　2结果
　　不育组与正常对照组精浆 NO含量分别为(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L，差异极显著（t=8.34， P&<0.01）. 分离的生精细胞出现细胞核固缩，在核周聚集，出现境界分明的新月形或块状小体. 凋亡的生精细胞在凋亡的初始阶段出现核膜间隙增宽，核电子密度增高，核膜与胞膜分离（Fig 1A）；核膜折叠，互相融合（Fig 1B）；胞膜与核膜裂解，核移外吐（Fig 1C）.
　　不育伴NO含量升高（&>135 μmol/L）患者12例（C组）生精细胞的凋亡率明显高于A组(15例正常有生育能力的健康男性)和B组(15例不育患者)（P&<0.01);B组与A组间有显著性差异（P&<0.05， Tab 1). 不育患者精浆中NO的含量与生精细胞的凋亡率呈正相关(r=0.85， P=0.001). 提示NO的浓度对精子的形成有一定影响.表1NO含量与生精细胞凋亡率（略）
　　3讨论
　　eNOS位于所有生精阶段的间质细胞和支持细胞胞质. 而在附睾和输精管上皮细胞中也发现有eNOS分布. 正常生精细胞中未发现有eNOS的分布，但在凋亡的精母细胞中有高浓度的eNOS表达. 本结果表明，男性不育组精浆NO含量明显升高者生精细胞凋亡率与正常对照组比较差异极显著（P&<0.01). 相关分析发现不育组精浆NO含量与生精细胞凋亡率呈正相关（r=0.85， P=0.001). 提示NO含量异常升高使生精细胞凋亡增加从而降低生育能力. NO通过脂质过氧化作用诱导生精细胞凋亡；NO能与睾丸生精细胞中的含铁酶相互作用，抑制生精细胞线粒体呼吸和能量产生；抑制与DNA合成有关的酶，使DNA合成减少;直接启动p53的表达［5］.
　　电镜观察发现，男性不育患者生精细胞出现核染色质浓缩、电子密度升高、核膜折叠、 融合或裂解等一系列变化. 对男性不育患者生精细胞的超微结构的观察，可进一步了解其不育的发生机制，对临床诊断和治疗提供病理形态依据具有重要的意义.
　　【参考文献】
　　［1］ Fujisawa M， Yamanaka K， Tanaka H， et al. Expression of endothelial nitric oxide synthase in the sertoli cell of men with infertility of various causes［J］. BJU Int， 2001;87(1):85-88.
　　［2］ 杨麦贵，张竹映，郑善銮，等. 外源性一氧化氮对精子运动能力的影响［J］. 第四军医大学学报，2003;24（15）：1397-1399.
　　Yang MG， Zhang ZY， Zheng SL， et al. An experimental study of nitric oxide effects on human sperm capacitation in vitro［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003; 24（15）：1397-1399.
　　［3］ Aksoy Y， Aksoy H， Akcay F. Does seminal plasma nitrite reflect nitrite+nitrate concentrations in leukocytospermic infertile men［J］? Am J Reprod Immunol， 2001;45(3):188-189.
　　［4］ 杨麦贵，张竹映，郝晓柯，等. 无精子症患者精子生成基因及一氧化氮水平的探讨［J］. 第四军医大学学报，2003;24（13）：1205-1207.
　　Yang MG， Zhang ZY， Hao XK， et al. Spermatoleosis gene and NO level in patients with azoospermia and oligozoospermia ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2003; 24（13）：1205-1207.
　　［5］ Sengok K，Tamate K，Yoshida T. Effect of low concentration of NO on the zona pellucida binding ability of human spermatozoon［J］. Fertil Steril，1998;69(4):522-526.