作者：肖菊香，来宝长，朱娟，李莉，白沛松，王一理
【关键词】 结直肠肿瘤
【Abstract】 AIM: To observe the tumor associated B7 family molecules mRNA expression on human colorectal cancerous tissue by in situ hybridization. METHODS: The mRNA expression patterns of cancer associated B71， B7H1， B7h3 and ICOS mRNA expression in 22 specimens of human colorectal cancer were monitored by the technique of in situ hybridization (ISH) with the Diogeneslabeled Oligonucleotideprobes. RESULTS: B71， B7H1， B7h3 and ICOS mRNA were detected in both cancer cells and tumor infiltrating lymphocytes (TILs). The mRNA expression level of these molecules in tumor cells was higher than that in TILs (0.76±0.54-1.62±0.82 vs 0.38±0.19-0.65±0.33， P&<0.01). There was no correlation between the expression level of tested B7 family molecules and the sex， age， differentiation status of cancer and regional lymph nodes metastasis of the patients. CONCLUSION: Th3 cytokine predominant in tumor microenvironment may be related to the expression of B7H1 and B7h3 cosignal molecules on tumor cells and TILs.
【Keywords】 colorectal neoplasms; B7; ICOS; tumor immunity; immune evasion
【摘要】 目的:通过原位检测B71，B7H1，B7h3和ICOS等分子mRNA在结直肠癌细胞及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中的表达， 以期探讨肿瘤微环境中Th3型细胞因子表达上调的可能机制. 方法:采用原位杂交技术，用地高辛标记的寡核苷酸探针检测了22例人结直肠癌组织B71，B7H1，B7h3和ICOS分子mRNA表达状况，并结合临床特点加以综合分析. 结果:肿瘤组织和肿瘤浸润淋巴细胞除表达B71外，均可见B7H1，B7h3 和ICOS mRNA表达，但肿瘤细胞的表达水平显著高于TIL的表达水平，具有显著性差异(P&<0.05)；B7家族分子在癌细胞和TIL中的表达均与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无区域淋巴结转移无关，在TIL中B7H1表达与肿瘤浸润深度有关（P&<0.05）；在癌细胞中则与之无关（P=0.155）；在癌细胞和TIL中B7H1和ICOS分子表达与远处转移之间具有显著性差异（P均&<0.01）. 结论:肿瘤细胞和TIL表达B7H1，B7h3和ICOS分子可能与肿瘤微环境中Th3型细胞因子占优势有关.
【关键词】 结直肠肿瘤；B7；可诱导共刺激因子;肿瘤免疫；免疫逃逸
0引言
肿瘤细胞逃逸宿主免疫反应一直是研究的热点. T淋巴细胞活化双信号机制的确立使人们以为肿瘤组织中的浸润免疫潜能细胞不活化是因为缺乏共刺激信号所致的免疫无能，加之有动物实验也证明B7共刺激分子基因修饰的肿瘤细胞可被荷瘤宿主排斥［1］，研究证实肿瘤细胞也表达B71，B7h3等共刺激分子，提示它们可能不是肿瘤免疫逃逸最主要的机制［2］. 我们利用B71，B7H1，B7h3和ICOS cDNA探针，原位杂交技术，分析人结直肠癌组织B7家族共刺激分子表达状况，探讨其与肿瘤病理分期的关系如下.
1材料和方法
1.1材料
1994/1996年我院外科根治性切除的结直肠癌患者的组织标本22例，术前未行放、化疗及免疫治疗. 所有标本均经病理证实，40 g/L中性甲醛固定、常规石蜡包埋，5 μm连续切片，DEPC水展片，裱贴于涂有APES的玻片上. 65℃烤片过夜，-70℃保存备用. 应用Primer3软件设计针对mRNA的寡核苷酸探针，探针的特异性均经BLAST软件测试，显示具有良好的特异性. Primer3网址：http://www.genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/Primer3， BLAST网址：http://www.ncbi.nlm.gov/cgibin/BLAST. 4种探针序列分别为：B71： 5′CATGAAGCTGTGGTTGGTTG3′; B7H1： 5′TGCTTGTCCAGATGACTTCG3′; B7h3： 5′CCATCGCTCTGACTTCCTTC3′; ICOS： 5′TTCAGCTGGCAACAAAGTTG3′.
1.2方法
探针用dig oligonucleotid tailing kit (Boehrinyer Mainheim)标记，严格按照产品说明书进行，探针活性为1.56 mol/L mRNA原位杂交:42℃预杂交2 h→42℃杂交22 h→梯度SSC清洗→地高辛抗体1 h→NBTBCIP显色→封片镜检. 整个操作均在无RNA酶的环境中按常规进行，组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，37℃下用1 mg/L蛋白酶K消化30 min，用2 g/L甘氨酸处理5 min，PBS冲洗， 40 g/L聚甲醛室温后固定20 min. PBS冲洗10 min. 再用0.2 mol/L HCl作用10 min. 用DEPC水洗3 min. 梯度乙醇脱水，室温干燥. 在42℃预杂交液10～30 mL盒内预杂交2 h. 然后加杂交液10～30 μL，在42℃杂交22 h，梯度SSC充分洗涤，加地高辛抗体37℃作用2 h，NBTBCIP显色18 h，BufferⅢ洗5 min终止显色反应，10 g/L甲基绿复染1～2 min流水冲洗，梯度乙醇脱水. 二甲苯37℃透明10 min×2. 中性树胶封片. 镜检，阴性对照，以PBS替代探针和抗体，或切片用Rnase A(20 mg/L) 37℃处理30 min. 慢性扁桃体炎组织中单个核细胞B71 mRNA表达为阳性对照. 光镜下细胞质中出现紫蓝色沉淀为阳性杂交信号，阴性对照无杂交信号，甲基绿复染的胞质不着色，胞核染绿色. 在装有网格目镜的高倍镜下，每张切片取5个视野，计数阳性细胞百分数，根据胞质中阳性颗粒数多少及颜色深浅分为阴性（-）、弱阳性（+）、阳性（）、强阳性（）分别为0，1，2，3分. 将百分率与染色级别积分的乘积做为共刺激信号分子mRNA表达的积分指数.
统计学处理: 使用SPSS 11.0软件分析，采用配对t检验及Spearman相关分析. P&<0.05为有统计学意义.
2结果
肿瘤组织和TIL除表达B71外，均有B7H1，B7h3和ICOS mRNA表达，但肿瘤细胞的表达水平显著高于TIL的表达水平(Fig 1)，具有显著性差异(P&<0.05， Tab 1)；B7家族分子在癌细胞和TIL中的表达均与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无区域淋巴结转移无关，在TIL中B7H1表达与肿瘤浸润深度有关（P&<0.05）；在癌细胞中则与之无关（P=0.155）；在癌细胞及TIL中B7H1和ICOS分子表达与远处转移之间具有显著性差异（P均&<0.01）；B7分子之间相互比较主要显示在B7H1与B7h3，B7h3与ICOS分子之间具有显著性差异（Tab 1，2）.表1结直肠癌肿瘤细胞和TIL中B7家族分子表达与转移的比较（略）表2肿瘤浸润深度与B7家族分子表达（略）
近年来，共刺激分子在T淋巴细胞活化中的作用越来越受到重视. Dong等［3］发现，B7家族共刺激分子对淋巴细胞的活化表现为不同的作用，使Th3型细胞因子占优势. Dong等［3］发现ICOS是T细胞活化后促进T细胞分化并发挥效应的主要协同刺激分子，在获得性免疫中发挥着主要作用. 这与以前我们研究结果肿瘤局部微环境中以Th3型细胞因子占优势相一致［4］，提示肿瘤局部存在免疫抑制. 本研究发现肿瘤组织和肿瘤浸润淋巴细胞均不同程度表达B71，B7H1，B7h3和ICOS分子，且在肿瘤细胞中的表达水平普遍较TIL中的表达水平为高（P&<0.01），其表达水平与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、有无区域淋巴结转移无关，在TIL中B7H1表达与肿瘤浸润深度有关（P=0.050）；在癌细胞中则与之无关；在癌细胞和TIL中，B7H1和ICOS分子表达与远处转移具有显著性相关；这一实验结果为上述解释提供了形态学上的支持依据. 最近Dong等［5］证实肿瘤相关B7H1在体内外均可促进人抗原特异性T细胞凋亡，从而加速高免疫原性B71+肿瘤生长. 推测本实验结果显示的丰富表达B7H1的人体结直肠癌通过诱导肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡可能是其免疫逃逸的另一重要机制. 杨欣伟等［6］报道的小鼠肝癌转染B7.1基因后在体内外可有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应的研究以及最近提出共抑制分子概念的阐明将有助于设计合理的基于T细胞的肿瘤免疫治疗新策略.
参考文献
［1］ Smyth MJ， Godfrey DI， Trapani JA. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy ［J］. Nat Immunol， 2001; 2（4）:293-299.
［2］ Chen XL， Cao XD， Kang AJ， et al. In situ expression and significance of B7 costimulatory molecules within tissues of human gastric carcinoma ［J］. World J Gastroenterol， 2003; 9(6):1370-1373.
［3］ Dong C， Juedes AE， Temann UA， et al. ICOS costimulatory receptor is essential for Tcell activation and function ［J］. Nature， 2001;409(6816):97-101.
［4］ Li R， Rottinger D， Li R， et al. Analysis of the immunological microenvironment at the tumor site in patients with nonsmall cell lung cancer［J］. Langenbeck’s Arch Surg， 2003;388(6):406-412.
［5］ Dong HD， Strome SE， Salomao DR， et al. Tumorassociated B7H1 Promotes T cell apoptosis: A potential mechanism of immune evasion ［J］. Nat Med， 2002;8(8):793-800
［6］ 杨欣伟，隋延仿，李增山，等. 小鼠肝癌细胞系Hepa16 B7.1瘤苗抗肿瘤免疫的实验研究［J］. 第四军医大学学报， 2003;24(6):502-505.