【Abstract】 AIM: To investigate the change of NogoA expression in cerebral cortex neurons after oxidative stress and its possible functions. METHODS: Primarily cultured cerebral cortex neurons in rats were treated with h3O2 for 8 h and the morphology of neurons was observed. Hoechst33342 and PI staining were performed to detect apoptosis and necrosis of neurons， and NogoA expression was detected by Western blot. RESULTS: We observed that soma of neurons condensed， rounded， even collapsed， and processes disrupted and shed after treatment with 10 μmol/L and 100 μmol/L h3O2. Hoechst33342 and PI staining showed that， compared with that of control group， the percentage of apoptosis and necrosis did not increase after neurons were treated with 1 μmol/L h3O2， while it significantly increased after neurons were treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L h3O2 (P&<0.05). Western blot analysis showed that NogoA expression had no difference with that of control group after neurons were treated with 1 μmol/L h3O2， whereas was significantly higher than control group after neurons were treated with 10 μmol/L and 100 μmol/L h3O2 (P&<0.05). CONCLUSION: Oxidative stress may upregulate the expression of NogoA in neurons， and NogoA is presumed to be involved in the pathological processes of CNS degenerative diseases.
【Keywords】 rat; neuron; oxidative stress; NogoA; Western blot
【摘要】 目的: 探讨大鼠大脑皮层神经元受到氧化应激后NogoA表达的变化及其可能的作用. 方法: 体外原代培养大鼠大脑皮层神经元，给予不同浓度h3O2处理8 h后，倒置相差显微镜下观察神经元的形态学变化、Hoechst33342和PI染色观察凋亡和坏死情况，然后Western blot观察NogoA的表达变化. 结果: 大鼠皮层神经元受到10和100 μmol/L h3O2刺激后，神经元出现胞体回缩、变圆甚至崩解，突起断裂、脱落等细胞受损的现象；Hoechst33342和PI染色观察到1 μmol/L h3O2时神经元凋亡和坏死比例与对照组相比没有差别，而10和100 μmol/L h3O2刺激后，神经元凋亡和坏死比例明显增加（P&<0.05）. Western blot结果显示，1 μmol/L h3O2时NogoA的表达量与对照组相比无明显差异，而在10和100 μmol/L时NogoA的表达量明显升高（P&<0.05）. 结论: 氧化应激可以上调神经元NogoA的表达.
【关键词】 大鼠；神经元；氧化应激；NogoA；Western blot
0引言
氧化应激在许多中枢神经系统（CNS）疾病的发生发展中起重要作用. 细胞受到氧化应激后基因表达发生改变，并伴随转录因子表达的改变以适应环境变化［1］. 神经元经h3O2处理后，转录因子Sp1（specificity protein 1）水平迅速升高而且与DNA结合能力也升高. NogoA是CNS损伤后最重要的轴突再生抑制因子. NogoA在CNS中还具有其他功能［2］. NogoA 5′端上游区有12个可与Sp1结合的位点，即Sp1可以调节NogoA的表达［3］. 我们体外培养大鼠大脑皮层神经元，给予h3O2刺激并观察NogoA的表达变化，以期探讨神经元内NogoA可能参与的作用.
1材料和方法
1.1材料
DMEM， FBS， Neurobasal medium， B27 supplement， DHanks平衡盐液购自Gibco公司；胰酶、多聚赖氨酸、EDTA， Hoechst33342和PI购自Sigma公司；6孔、24孔板购自NUNC公司；300 mL/L h3O2分析纯购自西安化学试剂公司；NogoA兔多克隆抗体由本室制备［4］；BM Chemiluminescence Western Blotting Kit购自Boehringer Mannheim公司. 新生SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 所用的6孔、24孔板和玻片预先经100 μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液37℃包被4 h，三蒸水洗3遍晾干备用.
1.2方法
新生SD大鼠经冷冻麻醉，碘酒乙醇消毒，无菌操作下，将头剪下放入预冷的DHanks平衡盐液中. 在解剖显微镜下分离并取出大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1 mm×1 mm×1 mm大小，加入胰酶－EDTA消化液，37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃1次. 随后吸出组织转移到装有预冷培养液（DMEM＋100 mL/L FBS）的离心管内，用巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内. 重复上述步骤2～3次，将所收集的上清经200目筛网过滤. 所得上清800 r/min离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液（DMEM＋200 mL/L FBS）并吹打成单细胞悬液. 调整细胞密度为3.0×105/cm2种入6孔板内，1.0×105/cm2种入24孔板中盖玻片上，放入CO2孵箱中. 培养4 h后将培养液换成Neurobasal medium＋B27 supplement. 培养24 h时加入新鲜配制的h3O2使其终浓度为1，10和100 μmol/L，对照组仅加同等量的DHanks平衡盐液，继续培养8 h.
1.2.1Hoechst33342和PI染色用h3O2处理神经元8 h后，将0.01 mol/L PBS稀释的Hoechst33342储存液（500 mg/L）加到培养液中使终浓度为10 mg/L，混匀后孵箱中孵育10 min，然后加PI储存液（500 mg/L）使其终浓度为10 mg/L，混匀后室温继续作用15 min后加入4 g/L多聚甲醛固定，PBS润洗后甘油封片. 荧光显微镜（Olympus BX 60）下计数凋亡和坏死细胞占总细胞的百分比. 计数时每组4张盖玻片，每张盖玻片选6个视野，取x±s表示. 1.2.2Western blot检测细胞样品经h3O2处理8 h后，0.01 mol/L PBS迅速洗1次，加入RIPA裂解液，用细胞刮子刮下细胞，收集到Eppendorf管中，用BCA方法对所抽提的蛋白质进行蛋白定量，将样品调整为相同蛋白浓度. 相同浓度和相同体积的蛋白样品加入4×样品缓冲液，100℃煮5 min，12 879 g离心5 min，然后进行80 g/L SDSPAGE，电转移至PVDF膜. PVDF膜在10 g/L封闭液中室温封闭1 h，5 g/L封闭液稀释的一抗（NogoA兔多克隆抗体，1∶3000）中室温孵育2 h. 分别用TBST（TBS＋1mL/L Tween 20）和5 g/L封闭液各洗膜2次，每次10 min. 5 g/L封闭液稀释的二抗（Antimouse/rabbit IgGPOD，1∶12 500）中室温孵育1 h. TBST洗膜4次，每次15 min. PVDF膜浸入发光液，X光片显影、定影. Western blot结果用Leica Q570图像分析软件进行测定，计算出各条阳性带的相对吸光度值.
统计学处理：应用Origin7.0统计学软件进行统计学处理，组间差异运用Oneway ANOVA方法进行分析，各组间的差别两两比较采用Tukey检验.
2结果
h3O2浓度为1 μmol/L时，大鼠皮层神经元的形态与对照组相比没有明显变化，神经元胞体周围有光晕，折光性好，突起伸展并相互交织成网状(Fig 1A，B)；10 μmol/L时细胞折光度下降，出现折光性强的死细胞，交织成网状的神经细胞突起部分呈断续状(Fig 1C)；100 μmol/L时大部分神经元胞体破裂，许多细胞出现皱缩、变圆，突起呈断线状，少部分死细胞漂浮在培养液中（Fig 1D）. Hoechst33342和PI染色观察到，h3O2为1 μmol/L时神经元凋亡和坏死比例（9.15±1.09)％与对照组（9.01±0.95)％相比没有差别，而10和100 μmol/L h3O2刺激后，神经元凋亡和坏死比例明显增加［（21.80±1.06)％ vs (49.33±1.78)％，P&<0.05］（Fig 2）.
Western blot结果显示，h3O2为1 μmol/L时NogoA（Mr约2.20×105）的表达量（28.88±2.61）与对照组（26.04±2.40）相比无明显差异，而在10和100 μmol/L时，NogoA的表达量比对照组明显升高（47.44±3.55 vs 78.25±3.42，P&<0.05， Fig 3）.
3讨论
我们以h3O2刺激造成神经元的氧化应激状态，从形态学上观察到随着h3O2浓度增加，神经元出现胞体回缩变圆甚至崩解、突起断裂、脱落等细胞受损的现象；从Hoechest33342和PI染色观察到凋亡和坏死随着h3O2浓度增加而增多. 神经组织对氧化应激刺激特别敏感. 氧化应激与细胞凋亡关系密切.
Oertle等［3］发现NogoA 5′端上游区有12个可以与Sp1结合的区域，并且Sp1可以调节NogoA的表达. 由于神经元受到h3O2刺激后，Sp1水平迅速升高，而且与GC丰富区的结合力也升高［5］. 我们观察到随h3O2浓度增加，NogoA表达水平逐渐升高. 推测h3O2刺激神经元后首先引起Sp1水平升高，Sp1进而调节NogoA表达使NogoA水平升高.
Dupuis等［6］证明肌萎缩侧索硬化（ALS）患者NogoA表达升高，认为NogoA可以作为诊断ALS的分子标志物. 由于氧化应激与CNS退行性疾病有密切关系，我们观察到h3O2引起神经元凋亡和坏死的同时NogoA表达升高，或许可以提示NogoA可能参与这些病理变化的形成.
参考文献
［1］ Fuangthong M， Helmann JD. The OhR repressor senses organic hydroperoxides by reversible formation of a cysteinesulfenic acid derivative［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002; 99:6690-6695.
［2］ Hunt D， Coffin RS， Anderson PN. The Nogo receptor， its ligands and axonal regeneration in the spinal cord: A review［J］. J Neurocytol， 2002; 31(2):93-120.
［3］ Oertle T， Huber C， Schwab ME. Genomic structure and functional characterisation of the promoters of human and mouse nogo/rtn4［J］. J Mol Biol， 2003; 325(2):299-323.
［4］ Jin WL， Liu YY， Liu HL， et al. Intraneuronal localization of NogoA in the rat ［J］. J Comp Neurol， 2003;458(1):1-10.
［5］ Ryu H， Lee J， Zaman K， et al. SP1 and SP3 are oxidative stressinducible， anti death transcription factor in cortical neurons ［J］. J Neuro Sci， 2003;23(9):3597-3606.
［6］ Dupuis L， Gonzalez de Aguilar JL， di Scala F， et al. Nogo provides a molecular marker for diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis ［J］. Neurobiol Dis， 2002;10(3):358-365.