作者：杨向民，邢金良，姚西英，张思河，陈志南
【关键词】 结直肠肿瘤
【Abstract】 AIM: To identify and express the Fab Fragment against human colorectal cancer in E.coli by cloning the Fab genes of the mAb CAb1. METHODS: Light chain and Fd fragments of MAb CAb1 were amplified by RTPCR and PCR products were sequenced and analyzed after being cloned into pMD18T vector. The expression vector FdL/pComb3 was obtained after subcloning light chain and Fd fragment gene into pComb3 and deleting the gⅢ gene. Then the vector FdL/pComb3 was transformed into XL1Blue E.coli strain and induced by IPTG. The specificity of the expression products was detected by ELISA and immunofluorescence staining methods. RESULTS: The Fab gene of MAb CAb1 was cloned and expressed in E.coli. The expression product CAb1 Fab possessed the activity to combine with cell strain SW480. CONCLUSION: We successfully construct an expression vector FdL/pComb3 to express monovalent Fab against human colorectal cancer.
【Keywords】 colorectal neoplasms; Fab genes; clone; expression
【摘要】 目的：从杂交瘤细胞中克隆mAb CAb1所编码Fab抗体基因，并在大肠杆菌中进行表达和鉴定. 方法：采用RTPCR方法，扩增mAb CAb1的Fd片段和全长κ链基因，分别克隆到T载体后进行序列测定和分析. 依次亚克隆两个基因到噬粒pComb3中，去除该载体上的gIII基因，构建成分泌表达载体FdL/pComb3. 转化XL1Blue E.coli菌株，IPTG诱导表达. 采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性. 结果：克隆了大肠癌mAb CAb1的Fab基因，并在E.coli中获得表达. 产物CAb1 Fab具有与大肠癌细胞株SW480特异结合的活性. 结论：成功构建了在E.coli中表达抗人大肠癌mAb CAb1的小分子单价Fab抗体的载体.
【关键词】 结直肠肿瘤； Fab抗体；克隆；表达
0引言
我国大肠癌发病率有增高的趋势［1］. 随着工程抗体技术的发展，mAb用于大肠癌的诊治获得了较大的进展. 采用放射性核素标记Fab抗体可使核素很好地在肿瘤组织浓聚，减少药物的毒副作用，为早期微小病灶和肿瘤的复发和转移治疗提供了有效的手段［2］. 因此我们通过对已制备的杂交瘤细胞株mAb CAb1的Fab基因进行克隆、表达和鉴定如下.
1材料和方法
1.1材料
杂交瘤细胞株［3］、表达载体pComb3及E.coli感受态菌株JM109和XL1Blue均为本室保存. Trizol为Gibco公司产品. cDNA第一链合成试剂盒购自Promega公司. TA克隆试剂盒、PCR试剂盒及限制性内切酶和连接酶，均为Takara产品. IPTG，FITC和HRP标记的羊抗鼠IgG购于华美公司.
1.2方法
收集处于对数生长期的CAb1杂交瘤细胞1×107，应用Trizol试剂提取总RNA，具体步骤参照试剂说明书进行. 最后一步选用100 μL DEPC处理的ddh3O溶解RNA，紫外法测定总RNA的浓度，甲醛变性电泳观察. 所余样品置于-70℃保存备用. 寡核苷酸引物设计参照文献［4］，设计克隆Fab基因的PCR引物，由上海申友公司合成. 用于扩增鼠κ轻链的PCR引物共6条：MKV1 5′GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT3′; MKV2 5′GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG3′; MKV3 5′GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA3′; MKV4 5′GGGGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT3′; MKV5 5′GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG3′; MKC 5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3′. 用于克隆鼠重链Fd的PCR引物5条：MHV 1 5′GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3′; MHV 2 5′GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT3′; MHV 3 5′GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT3′; MHFR1 5′AGGT（GC）(AC)A(GA)CT(GT)CTCGAGTC(AT)GG3′; MHCG1 3′5′AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT3′. 用于剔除轻链假基因和构建FdL/pComb3基因的特异引物pseudoCDR1 5′TCTGGCTATAGTTATATGCAC3′; pseudoCDR3 5′TGTAAGCTCCCTAATGTGCTG3′; MKVBACK 5′GATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCC3′. 其中，划线处为限制性酶切位点， 依次为：EcoRⅤ， SacⅠ， XbaⅠ， XhoⅠ， SpeⅠ.
1.2.1CAb1 Fab基因的克隆cDNA反转录体系：总RNA (2 μL) 1 μg，随机引物Oligo(dT)15 0.5 μg (1 μL)， MgCl2 (25 mmol/L) 4 μL， 5×dNTPs 2 μL， 10×缓冲液2 μL， RNase抑制剂0.5 μL，反转录酶AMV 15 U（0.75 μL），用水补至20 μL，其余步骤参见试剂盒进行. 取cDNA 2 μL为模板，用相应的配对引物扩增全长轻链和Fd基因，其余步骤参照PCR试剂盒说明书. 对轻链基因PCR产物，用引物pseudoCDR1，3进行PCR鉴定. 将轻链和Fd基因与pMD18T载体连接，转化JM109感受态细胞，获得克隆载体pMD18T/Fd和pMD18T/L. 对上述载体进行序列测定和分析. 选用NCBI和IMGT数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/；http://imgt.cines.fr:8104/cgibin/IMGTdnap.jv）进行结果分析.
1.2.2CAb1 Fab基因表达载体的构建选用引物MKVBACK和MKC，以pMD18T/L为模板，进行轻链的扩增（去掉肽部分，并引入正确的酶切位点），纯化定量后，选用Sac I+Xba I消化与双酶切的pComb3连接，转化并筛选鉴定. 然后，用Xho I+Spe I双酶切pMD18T/Fd，亚克隆Fd至pComb3/L，获得展示型载体pComb3/FdgIIIL，以Spe I+Nhe I酶切gIII，用T4 DNA连接酶将其环化为分泌型的表达载体FdL/pComb3.
1.2.3Fab基因的表达及鉴定挑取含FdL/pComb3单菌落，接种于5 mL 2×YTAG（含Amp 100 mg/L，2 g/L glucose）30℃过夜培养. 次日1%转接种于2×YTAG中，至A600 nm为0.8，5000 r/min离心10 min，弃上清，用2×YTI 200 mL (含Amp 100 mg/L，IPTG 0.8 mmol/L) 重悬菌体，30℃ 诱导培养24 h. 收集菌体，用适量PBS重悬，反复冻融，离心收集上清，过0.45 μm滤膜后，4℃保存备检. 以羊抗鼠IgG（10 mg/L）包被ELISA板，加50 g/L脱脂奶粉37℃封闭1 h，加入诱导空菌XL1Blue和FdL/pComb3转化未诱导菌及诱导菌的冻融离心上清50 μL，PBS作为空白对照. 加入HRP羊抗鼠IgG后，以TMB为底物显色，检测A450 nm值.
2结果
2.1总RNA的提取和检测将获得的总RNA取2 μL稀释50倍，紫外分光光度测定总RNA A260为0.312；A280为0.161，经计算，其浓度为625 mg/L (约100 μL). 甲醛变性总RNA电泳分析（Fig 1）.
2.2CAb1 mAb Fab段基因的克隆成功地扩增出Fd和轻链目的基因(Fig 2). 应用轻链假基因剔除引物二次扩增轻链PCR产物(Fig 2泳带1，4，5，6).用MKV1和MKC引物获得的轻链结果为阳性(Fig 3). 用MKV5和MKC引物获得的轻链为阴性.
2.3CAb1 mAb Fab段基因序列测定将扩增出Fd和轻链目的基因(Fig 2泳带6， 10)经纯化并克隆至T载体后，序列测定显示：VH基因长351 bp， 编码117个氨基酸；VL基因长336 bp，编码112个氨基酸. 两序列基因内无终止码，各含有两个维持抗体结构所必需的半胱氨酸， 均位于框架区(FR2区和FR3区). 且两个基因的CDR1， CDR2， CDR3和FR1， FR2， FR3， FR4等均有完整序列. 已克隆的CAb1 CH1属于IgG1，CL属于κ型. 所得轻链的VL基因序列及Fd片段的VH分别来自编码小鼠胚系基因: IGKV1110*01，IGKJ5*01；IGHV9S3*02，IGHDST4*01，IGHJ2*01. 所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区蛋白，为新的抗体基因.
2.4CAb1 mAb Fab段表达载体FdL/pComb3的构建构建重组载体FdL/pComb3经酶切鉴定显示，目的基因片段已正确插入载体pComb3中相应的酶切位点，约为660 bp（Fig 4）.
2.5Fab的诱导表达ELISA检测重组载体FdL/pComb3经 IPTG诱导后成功表达，未经IPTG诱导的FdL/pComb3，空白和空菌对照均阴性(Fig 5).
2.6免疫荧光染色的检测表达的CAbFab可与SW480细胞特异性结合(Fig 6)，但荧光强度稍弱于阳性对照；用抗乙脑病毒的mAb做阴性对照细胞未见荧光染色.
3讨论
亲本杂交瘤抗体基因决定了它所分泌抗体的特异性和亲和力，准确地获得该抗体基因也是进行基因工程抗体改造的前提. 在扩增该抗体Fd基因时，分别选用了匹配于Fd基因信号肽与FR1处的5′端引物和与重链铰链区3′端引物进行扩增，结果三条信号肽并未扩出目的条带而FR1处扩增得到，这可能与信号肽因变异而产生的多样性有关. 轻链全长通过选用的引物进行了成功的扩增和假基因剔除，所用的信号肽引物保证了获得可变区基因的准确性和可靠性. 虽然杂交瘤分泌可特定结合抗原的抗体，但可能含有两种功能性轻链（κ和λ）或两种功能性重链. 只有其中一种能与对应的重链或轻链结合成为特定抗原特异性的抗体. 因此在从杂交瘤细胞中克隆到抗体基因后，我们选用Fab原核表达系统鉴定所得基因编码蛋白对抗原结合活性的鉴定. 我们构建了可溶性表达载体FdL/pComb3，获得表达蛋白CAbFab后，应用ELISA和免疫细胞化学检测均证实，表达产物具有与大肠癌细胞株有较好的亲和力和特异性.
参考文献
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