作者：李成刚，高志清，刘瑞，梁欣，海春旭
【关键词】 过氧化氢
【Abstract】 AIM: To study the role of low concentration of h3O2 in promoting the proliferation of HepG2 cells so as to examine the role of NFκB and cell cycle in that process. METHODS: HepG2 cells were stimulated directly by h3O2. HepG2 cells were previously treated by 20 μmol/L PDTC for 2 hours before they were treated by 50 μmol/L h3O2. HepG2 cells in various phases of cell cycle were treated by 50 μmol/L h3O2. The proliferation of HepG2 cells was detected by MTT assay. RESULTS: h3O2 of 50 μmol/L stimulated the growth of HepG2 cells， while the proliferation induced by h3O2 was prevented by PDTC， an inhibitor of NFκB. h3O2 of 50 μmol/L stimulated the growth of HepG2 cells in G1 phase. CONCLUSION: Low concentration of h3O2 promotes the proliferation of HepG2 cells， partly through a NFκB dependent mechanism. The proliferation of HepG2 cells induced by h3O2 may have different sensibilities in different phases of cell cycle， and it occurs mainly in G1 phase of cell cycle.
【Keywords】 hydrogen peroxide; HepG2 cells line; cell pision; cell cycle
【摘要】 目的： 探讨低剂量过氧化氢（h3O2）对人肝癌细胞株HepG2的促增殖作用及该作用与NFκB和细胞周期的关系. 方法： 不同剂量h3O2直接作用于培养的HepG2细胞；20 μmol/L NFκB抑制剂（PDTC）预处理细胞2 h， 50 μmol/L的h3O2作用HepG2细胞；50 μmol/L h3O2分别作用于G1， G2/M， S期细胞，MTT法测定细胞增殖活性. 结果： 50 μmol/L的h3O2具有明显的促进HepG2细胞生长的作用，此作用可以被PDTC抑制；50 μmol/L的h3O2可以明显的促进G1期HepG2细胞生长. 结论： 低剂量h3O2可诱导HepG2细胞增殖，该过程可能包含依赖NFκB的信号途径的参与；h3O2诱导HepG2细胞增殖在细胞周期的不同时相效应敏感性不同，主要诱导G1期细胞增殖.
【关键词】 过氧化氢；HepG2细胞系；细胞分裂；细胞周期
0引言
近年来对于活性氧（reactive oxygen species， ROS）、自由基(free radicals， RF)对细胞增殖作用的研究越来越多. 有研究表明，ROS不仅可以刺激正常细胞增殖、转化，也可以刺激肿瘤细胞增殖［1-3］，它还可以通过参与信号途径来促进细胞表达多种参与生理、病理过程所需要的分子［4］，且这种作用存在时间―效应关系和剂量―效应关系. 但对于外源性h3O2直接作用于肿瘤细胞，促进细胞增殖与启动信号途径和细胞敏感周期关系的研究还很少，我们通过h3O2作用于人肝癌细胞株HepG2，初步探讨其促进肿瘤细胞增殖与NFκB途径和细胞敏感时相的关系.
1材料和方法
1.1材料
肝癌细胞株HepG2由第四军医大学病理学教研室惠赠；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；新生牛血清为郑州佰安生物公司产品；h3O2为西安试剂厂产品，4℃避光保存；Thiazolyl Blue， Dimethyl Sulfoxide （DMSO）， Pyrrolidine dithiocarbamate （PDTC） 、胸腺嘧啶核苷（TdR）均购自美国Sigma公司；970CRT荧光分光光度计由上海三科仪器有限公司生产，ZS2板式酶标仪为北京新风机电技术公司产品.
1.2方法
1.2.1细胞培养HepG2细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化传代后，接种于RPMI1640完全培养基中，培养基中含100 mL/L新生牛血清、2 g/L NaHCO3、链霉素100 mg/L、青霉素10×104 u/L，置37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度孵箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长状态.
1.2.2MTT比色法检测细胞增殖活性取对数生长期HepG2细胞2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培养基终止消化，调整细胞密度为5×107/L，以每孔200 μL接种于96孔板，培养12 h后加入终浓度分别为0.1， 1， 2， 5， 10， 20， 50， 100， 1000 μmol/L的h3O2，另外设阴性对照孔并用单纯培养基作空白孔. 细胞分别于h3O2处理1， 24和48 h后每孔加入5 g/L MTT 20 μL， 37℃孵育4 h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min使紫色结晶物充分溶解，用ZS2板式酶标仪，波长为492 nm，检测各孔吸光度值.
1.2.3PDTC对h3O2促增殖作用的影响细胞接种方法同前，培养10 h后，每孔加入终浓度为20 μmol/L PDTC 2 h后，以终浓度为50 μmol/L的h3O2分别处理1， 24和48 h， MTT法检测细胞增殖状况，方法同前.
1.2.4TdR诱导细胞同步化取处于对数生长期的HepG2细胞，用终浓度为2.5 mmol/L的TdR分别同步化得到S， G2/M和G1期HepG2细胞，具体方法参照文献［5］.
1.2.5h3O2对同步化细胞的作用取按上述方法所得S， G2/M和G1期细胞，用终浓度为50 μmol/L 的h3O2分别作用1， 24， 48 h， MTT法检测增殖效果，方法同前.
统计学处理： 实验数据以x±s表示，采用方差分析比较组间差异，组间差别的多重比较采用Dunnettt检验方法. 数据处理采用SPSS11.0统计软件进行.
2结果
2.1不同剂量h3O2对HepG2细胞的作用实验结果显示，50 μmol/L终浓度的h3O2作用细胞24 h后，吸光度值与对照组相比显著升高（P&<0.01）；1 mmol/L h3O2作用细胞1 h后，吸光度值与对照组相比明显降低（P&<0.05， Fig 1）.
2.2PDTC对h3O2促增殖作用的抑制作用20 μmol/L PDTC预处理细胞2 h后，给予50 μmol/L h3O2作用细胞，吸光度值与对照组相比无显著性差异（P&>0.05），而单独给予50 μmol/L h3O2作用细胞24 h，吸光度值与对照组相比显著升高（P&<0.01， Fig 2）.
2.3h3O2对同步化HepG2细胞的作用50 μmol/L h3O2作用G1期细胞后，与对照组相比，吸光度值显著升高（P&<0.05），而50 μmol/L h3O2作用S， G2/M期细胞后，光吸收值与对照组相比，无显著性差异（Tab 1）.表150 μmol/L h3O2对不同时相HepG2细胞增殖的影响（略）
3讨论
活性氧、自由基是体内一系列重要的生物活性分子，参与多种生理、病理过程［6，7］. 细胞信号途径可以被诸如活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等间接启动，或是直接由质膜与刺激因素接触并被上皮细胞或是间质细胞摄取. 细胞信号级联反应可以引起氧化还原敏感转录因子、NFκB， AP1的活化，这些转录因子的活化可能与控制细胞发生增殖反应有关［8］. 许多研究表明，细胞增殖是通过包含以ROS作为信号分子在内的信号途径的调控来实现的［9］，并且一些刺激细胞在发生增殖反应的过程中，ROS作为信号分子是必需的. 外源性活性氧信号和细胞内源性活性氧信号都参与了促进细胞增殖的过程［10］，而且许多证据表明氧化信号刺激细胞增殖部分是通过活化NFκB来实现的［11］.
NFκB已被证明是调节细胞生长的一种主要物质［12］，一般情况下NFκB与抑制分子IκB结合以非活化形式存在于细胞质中. 当NFκB被h3O2等刺激活化后，IκB发生磷酸化和泛素化，继而降解而与NFκB解离，由p50和p65两个亚基组成的NFκB二聚体从细胞质快速转移至细胞核中［13］，该过程涉及到参与细胞增殖、凋亡和迁移有关基因的表达，并受到氧化/还原过程的调控. ROS对NFκB的活化可能是必需的，内源性h3O2引起向核内转移的p65增多，并伴有NFκBDNA结合物及反式激活的基因数量减少，同时氧化应激本身也可以促进NFκB由胞质向核内转移.
以往研究发现中浓度的h3O2作用可引起肿瘤细胞发生凋亡，并且这种作用与细胞敏感时相有关［5］. 基于这些结果，我们探讨了低剂量h3O2促肿瘤细胞增殖作用与细胞周期的关系. 实验结果显示，用50 μmol/L h3O2作用于同步化G1期细胞后，与对照组相比，光吸收值显著升高，提示h3O2对该期细胞具有促增殖作用，而50 μmol/L h3O2作用于同步化S， G2/M期细胞后，吸光度值与对照组相比无显著变化，提示G1期为h3O2发挥促增殖作用的主要时期. 因此，h3O2促进肿瘤细胞增殖可能与细胞敏感时相有关，其作用机制有待进一步探讨.
参考文献
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