作者：武永飞，张建华，李生斌
【关键词】 兴奋性毒性
【Abstract】 AIM: To investigate the involvement of Endonuclease G (EndoG) in excitatory amino acids induced neuronal apoptosis. METHODS: EndoG expression in the hippocampus of EndoG+/+ mice and EndoG+/- mice was analyzed by Western blotting. Kainic acid (KA) was taken to induce seizure behavior and excitotoxicity in EndoG+/- mice and EndoG+/+ mice. The terminal deoxynucleotidyl transferasemediated UTP nick endlabeling (TUNEL) assay was used to detect neuronal apoptosis in the hippocampus after KA treatment. RESULTS: We found that EndoG expression in the hippocampus of EndoG+/- mice was reduced more than 40% compared to that in EndoG+/+ mice. The reduction of EndoG expression levels in the hippocampus did not result in altered KAinduced seizure severity in EndoG+/- mice compared to that in EndoG+/+ mice. However， the KAinduced apoptotic cells in both CA3 and CA1 in EndoG+/- mice were reduced by about 35% in comparison with those in EndoG+/+ mice. CONCLUSION: The reduced expression of EndoG in the hippocampus of EndoG+/- mice leads to resistance to excitotoxicityinduced apoptosis.
【Keywords】 Endonuclease G; apoptosis; excitotoxicity; kainic acid; hippocampus
【摘要】 目的：研究Endonuclease (EndoG)是否参与由兴奋性氨基酸所诱导的神经细胞凋亡. 方法：用Western blotting法检测EndoG+/-小鼠及EndoG+/+小鼠海马结构中EndoG的表达. 用KA诱导抽搐反应及神经细胞凋亡. 用TUNEL法分析EndoG+/-小鼠及EndoG+/+小鼠海马结构中神经细胞凋亡的情况. 结果：EndoG在EndoG+/-小鼠海马结构中的表达比在EndoG+/+小鼠中降低40%以上. KA作用后，EndoG+/-小鼠与EndoG+/+小鼠表现出相同的神经兴奋性. KA作用后，与EndoG+/+相比，EndoG+/-小鼠海马结构CA3，CA1亚区细胞凋亡下降了约35%. 结论：EndoG参与了由兴奋性毒性所诱发的神经细胞凋亡.
【关键词】 脱氧核糖核酸酶BamHI; 凋亡; 兴奋性毒性; 红藻氨酸; 海马
0引言
兴奋性毒性是一个由谷氨酸或其他兴奋性氨基酸所诱发的中枢神经系统神经细胞死亡的过程［1， 2］. 兴奋性毒性在持续性癫痫、脑外伤、脑缺血及低血糖等诱发的人类脑细胞死亡的病理发生中发挥作用，是一些退行性神经病变的共同机制. 三种亚型的谷氨酸受体［包括NmethylDaspartate（AMPA）受体， αamino3hydroxy5methyl4isoxazole propionic acid（NMDA）受体和kainic acid（KA）受体］过度激活会增加细胞内的Ca2+和Na+，从而剧烈地改变正常细胞的生理环境，导致神经细胞死亡［1， 2］. Endonuclease G（EndoG）是由细胞核基因编码的存在于线粒体膜间隙的一种DNA酶，在细胞凋亡时，它会转位到细胞核内，在DNA fragmentation中起酶切作用［3-6］. 我们以往的研究［7］观察到EndoG为小鼠早期胚胎发育和细胞正常凋亡所必需. EndoG-/-胚胎在发育的2.5~3.5 d即死亡. 与野生型小鼠相比，来自EndoG+/-小鼠脾脏及胸腺的淋巴细胞对凋亡的刺激具有更强的耐受性. 但EndoG是否参与神经细胞凋亡? 为此，我们分析了EndoG在EndoG+/-小鼠及野生型小鼠海马结构内的表达，并比较了KA诱导后EndoG+/-小鼠及野生型小鼠的兴奋性及由兴奋性毒性所导致的海马神经元凋亡情况的差异.
1材料和方法
1.1材料
8~10 wk龄的小鼠36只用于实验(EndoG+/-小鼠及EndoG+/+小鼠各18只). EndoG+/-小鼠的来源及基因分型方法见文献［7］. 实验前3 d，所有小鼠单独饲养. 所用实验程序经University of Cincinnati动物保护和使用委员会批准，并严格遵守NIH实验动物保护和使用准则. KA购于Sigma公司，先溶于生理盐水，并用NaOH中性化.
1.2方法
1.2.1Western blotting检测从EndoG+/-小鼠及EndoG+/+小鼠的海马结构提取总蛋白，按Zhang等［7］的方法，每个样本各取总蛋白20 μg，经150 g/L SDS/PAGE胶电泳分离，转膜后，用兔抗EndoG抗体及碱性磷酸酶标记的山羊抗兔抗体（Santa Cruz Biotechology，US）作用，并用化学发光剂（Amersham Biosciences，UK）进行感光，并用灰度扫描法获取数据.
1.2.2抽搐评分将KA按30 mg/kg，腹腔注射于小鼠体内，连续观察60 min，并按照Yang等［8 ］的方法进行打分.
1.2.3切片制备KA注射后5 d，用苯巴比妥麻醉小鼠，用PBS及含40 g/L多聚甲醛的PBS灌注，断颈后去颅骨，分离脑组织，在含40 g/L多聚甲醛的PBS中4℃过夜固定，在200 g/L蔗糖溶液中4℃浸泡48 h，用冰冻切片机作40 μm厚的冠状系列切片，按编号放入冰冻保护剂，-20℃保存备用.
1.2.4神经细胞丢失及凋亡检测切片经PBS漂洗3~4 h，室温干燥至少3 h，从嘴侧到尾侧，按每4张取1张的方法，选取切片，以保证选样能均匀覆盖整个海马结构. 用cresyl violet进行染色，以检测海马CA3亚区内的神经细胞丢失. 采用Metamorph图像分析系统，对神经细胞丢失体积进行定量. 再按从嘴侧到尾侧每8张取1张的方法，选取切片，以Zhang等［9 ］的TUNEL方法检测海马结构内神经细胞的凋亡.
统计学处理： 用Studentt检验分析两组动物海马结构内EndoG的表达及神经细胞丢失与凋亡差异. 以重复测量方差分析处理两组动物的神经兴奋性水平. P&<0.05为有统计学意义.
2.1EndoG在EndoG+/-及EndoG+/+小鼠海马结构中的表达Fig 1显示的是用Western blotting检测EndoG在两组小鼠海马结构内表达的结果. 用灰度扫描法获取数据，并以βactin作为内对照对EndoG的表达进行归一化处理. 结果表明，当EndoG+/+小鼠海马结构内EndoG的表达归一化为1.0的情况下，EndoG在EndoG+/-小鼠海马结构中的表达为0.59. Studentt检验显示EndoG在两组动物海马结构中的表达有显著性差异（P&<0.05）.
2.2KA诱导的EndG+/-小鼠与EndoG+/+小鼠的神经兴奋性Fig 2显示KA注射后60 min内EndoG+/-小鼠及EndoG+/+小鼠的抽搐发作状况. 在KA作用的前30 min内，两组动物抽搐发作进行性加重，此后达到峰值水平（Fig 2）. 重复测量的方差分析法显示，两组动物间兴奋性水平没有显著性差异（P&>0.05）.
2.3KA诱导的EndoG+/-小鼠与EndoG+/+小鼠海马CA3， CA1亚区细胞丢失与凋亡Fig 3A，3B显示，KA注射后5 d，经cresyl violet染色，EndoG+/-小鼠CA3亚区内的细胞丢失面积明显低于EndoG+/+. 定量分析表明，在CA3亚区两组间的细胞丢失体积有显著差异（P&<0.05， Fig 3E）. Fig 3C，D显示，经TUNEL检测， EndoG+/-小鼠CA3和CA1亚区内的神经细胞凋亡数量比EndoG+/+明显降低. 定量分析表明，两组间的细胞凋亡水平有显著性差异（P&<0.05， Fig 3F）.
3讨论
EndoG是在进化上非常保守的由细胞核基因编码的存在于线粒体膜间隙的一种DNA酶，在细胞凋亡时，它会转位到细胞核内，在DNA fragmentation中起酶切作用［3-6］. 生化研究证实［5］，在特定的凋亡因素诱导下，EndoG以caspase非依赖的方式切割DNA. 遗传分析显示［6］，在C. elegans内，EndoG参与构成DNA降解复合物，从而在DNA fragmentation和细胞凋亡中发挥作用，也可单独对DNA发生切割作用. 这些研究说明，EndoG参与了一条源自线粒体的细胞凋亡信号传导通路. 我们以前的实验表明［7］，EndoG在EndoG+/-小鼠来源的脾脏和胸腺淋巴细胞中的表达比EndoG+/+明显降低，并导致这些细胞对凋亡的更高的抗性. 我们的研究发现，EndoG在EndoG+/-小鼠海马结构中的表达比在EndoG+/+中降低40%以上（Fig 1）. 而在KA作用后， EndoG+/-小鼠与对照组小鼠表现出相似的兴奋性水平（Fig 2），这说明EndoG不参与对神经兴奋性的调节. 那么，与对照组相比，在EndoG+/-小鼠海马结构中神经细胞死亡的减少便直接归结于EndoG表达水平的下降，即EndoG是参与由兴奋性毒性所诱发的神经细胞凋亡的效应分子. 结合以前的研究［5，6，9］，我们还可以得出这样的结论：神经细胞与其他组织细胞具有共同的细胞凋亡分子机制.
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参考文献
】［1］ Choi DW. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system ［J］. Neuron， 1988; 1: 623-634.
［2］ Choi DW. Excitotoxic cell death ［J］. J Neurobiol， 1992; 23: 1261-1276.
［3］ RuizCarrillo A， Renaud J. Endonuclease G: A (dG)n X(dC)nspecific DNase from higher eukaryotes ［J］. EMBO J， 1987; 6: 401-407.
［4］ Cote J， RuizCarrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G ［J］. Science， 1993; 261: 765-769.
［5］ Li L， Lou X， Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria ［J］. Nature， 2001; 412: 95-99.
［6］ Parrish J， Li L， Klotz K， et al. Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. elegans ［J］. Nature， 2001; 412: 90-94.
［7］ Zhang J， Dong M， Li L， et al. Endonuclease G is required for early embryogenesis and normal apoptosis in mice ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003; 100: 15782-15787.
［8］ Yang DD， Kuan C， Whitmarsh AJ， et al. Absence of excitotoxicityinduced apoptotis in the hippocampus of mice lacking the Jnk3 gene ［J］. Nature， 1997; 389: 865-870.
［9］ Zhang J， Lee H， Agarwala A， et al. DNA fragmentation factor 45 mutant mice exhibit resistance to kainic acidinduced neuronal cell death ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2001; 285:1143-1149.