作者：郭晓彤 张积仁 李立文
【关键词】 肿瘤
【摘要】 蛋白转导技术是近些年迅速发展起来的一种跨膜转运技术. 应用该技术可以将多种药物，包括化合物、多肽、核酸等，高效地转运到细胞内，其过程不依赖于能量和受体，而是由在生理pH条件下带正电荷的、富含碱性氨基酸残基的多肽序列即蛋白转导功能域所介导. 目前蛋白转导技术已经不仅仅是一种可以提高药物进入细胞效率的药物转运技术，而且被广泛用做肿瘤基因治疗的辅助手段来增强对肿瘤组织的杀伤效率. 最近研究表明，HIV1 TAT， HSV1 VP22和果蝇触角足同源蛋白等的蛋白转导功能域尚可引导与之融合表达或共价结合的抗原进入MHC I类分子依赖的抗原提呈途径，并显著提高抗原特异性CTL的产生水平，其作用机制涉及介导抗原在细胞内和细胞间播散、增强抗原表达水平、促进CTL表位的加工和释放并提高抗原表位向细胞表面的提呈等. 这些资料表明蛋白转导功能域可以显著提高肿瘤疫苗的免疫效能，激发机体产生高水平的抗原特异性CTL，从而对肿瘤组织产生最大的免疫杀伤效应.
【关键词】 蛋白转导；肿瘤，疫苗；应用前景
0引言
蛋白转导技术是指利用蛋白转导功能域将与之共价结合的化合物、肽、核酸或与之融合表达的全长蛋白质通过非受体依赖、非转运蛋白依赖、非能量依赖方式运送至细胞内的一种技术. 蛋白转导作用不是通过全长蛋白发生的，而是依赖于长约10～16个氨基酸残基、富含碱性氨基酸残基、在生理pH值条件下带净正电荷的氨基酸序列，该序列即被称为蛋白转导功能域(protein transduction domain， PTD). 现已发现多种蛋白或多肽含有PTD，如HIV1 TAT， HSV1 VP22以及果蝇触角足同源蛋白（Drosophila Antennapedia homeoprotein，pANTP）等，其中对HIV1 TAT， HSV1 VP22的研究报道较多. 最近研究表明蛋白转导技术不仅可显著提高药物进入细胞的效率，而且可作为肿瘤基因治疗的辅助手段来提高对肿瘤组织的杀伤效率，还可以引导特定抗原进入MHC I类分子依赖的抗原提呈途径，显著增强肿瘤疫苗的免疫效能. 本文我们对蛋白转导功能域和其在肿瘤疫苗研究领域的应用做一简单介绍.
1HIV1 TATPTDHIV1 TATPTD是指位于TAT蛋白第47至第57个氨基酸残基组成的多肽序列，其中包含9个碱性氨基酸残基，在生理pH值条件下带较高正电荷，可与细胞表面的硫酸肝素等分子作用，使蛋白发生跨膜运动. 现已成功应用TATPTD将多种蛋白包括铜锌超氧化物歧化酶、增强型绿色荧光蛋白、抗凋亡蛋白BclXL和PEA15等转运入多种类型的人或小鼠细胞.
1996年Moy等［1］以卵清蛋白作为模型抗原首次证实HIV1 TAT可以引导抗原进入MHC I类分子依赖的抗原加工和提呈途径，其激发机体产生抗原特异性CTL的能力与在体表达卵清蛋白激发的免疫反应相当. 次年Kim等［2］使用TATPTD与卵清蛋白共价交联后加载于树突状细胞也获得了相同结果，表明TATPTD可以通过将蛋白抗原转位至树突状细胞的胞质，从而使之以依赖抗原加工相关转运体(transporter associated with antigen processing，TAP)的方式高效进入MHC I类分子依赖的抗原提呈途径. 进一步研究发现，HBc18-27表位虽然可通过竞争性结合细胞表面的HLAA2分子来有效抑制CEA691表位对靶细胞的致敏能力，但对CEA691TATPTD融合肽的致敏能力没有任何影响，表明CEA691TATPTD融合肽必须经细胞内加载过程才能致敏靶细胞，同时胰酶降解试验证实其作用依赖于HIVTATPTD的完整性［3］. 应用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)的CTL表位NP118作为模型抗原进行研究发现，TATPTDNP118肽能够以TAP非依赖方式进入MHC I类分子抗原提呈途径，而使用编码表达TATPTDNP118的质粒作为基因疫苗时，即在细胞内表达产生TATPTDNP118肽时，该融合抗原则依赖于蛋白酶体和TAP进入MHC I类分子抗原提呈途径. 同时发现TATPTD可提高抗原提呈速度、减少用于刺激CD8+ T细胞反应所需的抗原提呈细胞数量，增强激发抗原特异性CTL反应的能力，并证实了交叉提呈不在该过程中发挥主要作用［4］，推测可能与TATPTD增强抗原表位向细胞表面提呈有关［5］. 应用TATPTDTRP2多肽抗原致敏树突状细胞，可使小鼠获得针对B16肿瘤的保护性免疫，比使用TRP2多肽时所诱发的抗原特异性CTL水平约高3～10倍，T细胞亚型耗竭实验和基因敲除小鼠实验均证实抗瘤免疫依赖于CD4+和CD8+ T细胞的同时存在［6］. 在另一研究中，接种重组TATPTDTRP2融合抗原可抑制约58%的小鼠肿瘤生长，而单纯接种TRP2时仅为35%［7］. 加载TATPTDHer2/neu胞外功能域融合蛋白的树突状细胞可有效激发患者淋巴细胞产生Her2/neu特异性抗瘤免疫［8］. 此外在对日本脑炎病毒非结构抗原的研究中，也发现HIV1 TATPTD可增强非结构抗原激发特异性抗病毒免疫的能力［9］. Lu等还利用furin敏感接头构建了多个表位与HIV
1 TAT
PTD的融合疫苗，并证实furin敏感性接头是引发多个表位同时发挥作用的关键所在［10］.
那么HIV1 TATPTD能否增强全长蛋白的免疫效果呢？利用LCMV核蛋白作为模型抗原研究发现，该抗原与HIV1 TATPTD融合并不能增强其免疫原性，而且不能提高全长蛋白编码表位的提呈作用，然而TATPTD和LCMV核蛋白中的NP396表位融合表达却能够大大提高对NP396表位的提呈作用［11］. 在使用卵清蛋白作为模型抗原的研究中却发现，TATPTD卵清蛋白融合抗原可有效被树突状细胞加工提呈，并可激发高水平的抗原特异性CTL反应［12］. 此外以人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type16，HPV16)的E7抗原为模型抗原的研究也表明E7TATPTD融合抗原诱发保护性免疫的能力显著高于单独应用E7抗原［13］. 应用不同的模型抗原得出了不同的结果，其原因尚待阐明.
2HSV
1 VP22VP22是构成人HSV1成熟病毒颗粒被膜和衣壳之间的病毒衣被的主要成分. VP22由UL49基因编码，为一碱性蛋白，Mr约为38×103，有磷酸化和非磷酸化两种形式，参与细胞间运输、与微丝结合、诱导细胞骨架萎陷，而且还参与有丝分裂过程中核转位、与染色质和核膜结合等. 尽管VP22本身无信号序列，但其却可通过非典型的非高尔基体依赖的分泌方式从其合成细胞运送至胞外，而后又被细胞高效摄入. 现已证实，VP22作为外源蛋白加入培养基后可被细胞直接摄取，且可将绿色荧光蛋白、p53， 人单纯疱疹病毒胸苷激酶和β半乳糖苷酶等大分子蛋白转运至COS1， Hela和BHK21等细胞内.
Cheng等［14］发现应用HPV16 E7抗原做为模型抗原与VP22融合可显著增强基于Sandbis病毒的RNA疫苗的免疫效能，其激发的抗原特异性CTL可有效杀伤表达E7的肿瘤细胞，其机制可能涉及直接激发（direct priming）和交叉激发（cross priming）. Hang等使用pcDNA3作为疫苗载体制备基因疫苗免疫小鼠，证实VP22与E7抗原融合后诱发E7特异性CD8+ T细胞前体的能力比单独使用E7抗原增强约50倍，而使用没有蛋白转导功能的截短型VP221267则没有任何免疫增强作用，同时各接种组的E7抗原特异性抗体反应没有显著差异［15］. Michel等［16］也证实VP22可显著增强HPV16 E7抗原的免疫原性，并认为融合抗原表达水平的提高参与增强机制. 此外使用VP22尚可诱发较高水平的E7特异性CD8+记忆T细胞，显著延长了保护性抗瘤免疫的持续时间［17］. 以上资料表明VP22介导的E7抗原在细胞内及细胞间播散以及融合抗原的表达水平是决定其增强激发抗原特异性CTL能力的关键因素. 使用牛疱疹病毒编码的BVP22与黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)融合蛋白基因疫苗肌肉注射免疫小鼠后可激发较强的Th1免疫反应，同时获得高水平的YFP特异性CTL反应［18］. 与HSV1 VP22有较高同源性的、由I型Marek氏病毒UL49基因编码的VP22蛋白也可有效增强HPV16 E7抗原的免疫原性［19］.
3pANTP PTD
果蝇触角足同源结构域存在于果蝇触角足同源蛋白(homeoprotein)家族，该家族成员是参与发育过程的一组转录因子，并通过高度保守的、位于羧基末端、由60个氨基酸残基构成的且排列成3个α螺旋的同源结构域(homeodomain)来识别并结合DNA，该同源结构域可转位穿过神经元细胞膜并进入细胞核. 进一步研究发现在该同源结构域中仅由16个氨基酸残基构成的第三个α螺旋即具有此转位活性，故被称为果蝇触角足蛋白转导功能域(pANTP PTD).
pANTP PTD与CTL表位pCw3或流感病毒衣壳蛋白147~156肽的融合蛋白可引导抗原肽进入MHC I类分子依赖的抗原提呈途径，使用融合蛋白免疫小鼠后可激发抗原特异性CTL反应，然而其在体的免疫激发作用依赖于十二烷基硫酸钠（SDS）的存在. 由于SDS不能作为免疫佐剂用于人体，故作者对接种方法进行了优化，发现使用脂质体不仅能够避免融合抗原在血清中的降解，而且可辅助融合抗原进入MHC I依赖的抗原提呈途径［20］，另外应用CpG免疫刺激序列可进一步提高接种效果. Pietersz发现pANTP PTD与卵清蛋白SIINFEKL CTL表位的融合肽可迅速被抗原提呈细胞内化，免疫C57BL/6小鼠后可激发CTL反应并获得对表达卵清蛋白的E.G7OVA肿瘤的保护性免疫［21］. 接种pANTP PTDgp100209融合多肽也可有效激发抗原特异性CTL反应，其机制涉及内肽酶furin和氨肽酶、羧肽酶在分泌途径中加工、释放CTL表位［1］. 此外pANTP PTDOVA257264融合抗原尚可通过涂抹于刮除角质层的皮肤来达到接种效果［22］.
综上所述，蛋白转导功能域可有效增强表位疫苗的免疫原性，显著提高激发抗原特异性CTL反应水平，在发展新型肿瘤疫苗中有很高的应用价值和临床应用前景. 然而，在设计疫苗时蛋白转导功能域、抗原表位、融合方法以及接头的选择等都会直接影响到疫苗的免疫效能. 此外，如何提高融合抗原在细胞内的表达水平并延长其半衰期，也是合理设计疫苗时必须考虑的关键因素.
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