作者：周娟，杨予白，奥沛源，雷立权
【关键词】 内皮缩血管肽
【Abstract】 AIM: To investigate the influence of dehydroepiandrosterone on the synthesis of NO， secretion of ET1 and the expression of ICAM1 in endothelial cells. METHODS: The cultured human umbilical vein endothelial cells ECV304 was treated by DHEA and the level of NO and ET1 in medium was detected by nitrite/nitrate colorimetric method and radioimmunoassay. The surface expression of ICAM1 on cells was detected immunohistochemically. RESULTS: In comparison with those of control， the content of NO in medium decreased from (387±12) to (242±11) μmol/L (P&<0.05)， but the concentration of ET1 in medium increased from (397±13) to (626±29) ng/L (P&<0.05) along with the increase of concentration of DHEA. The content of NO in medium of control group was similar at every time point（P&>0.05）， but DHEA timedependently decreased the content of NO (P&<0.05). The concentration of ET1 in medium timedependently increased both in control group and in DHEA group (P&<0.05)， and it was higher in DHEA group. Higher concentration of DHEA or longer treatment time， DHEA did not affect the ICAM1 expression. CONCLUSION: DHEA can adjust the function of vessels by regulating the production of NO and ET1 of endothelial cells.
【Keywords】 dehydroepiandrosterone; ECV304 cells; nitric oxide; endothelin1; intercellular adhesion molecule1
【摘要】 目的： 观察脱氢表雄酮对内皮细胞NO合成、ET1分泌及细胞表面ICAM1表达的影响. 方法： 培养的人脐静脉内皮细胞系ECV304经不同浓度和不同作用时间DHEA处理后，采用硝酸还原酶及放免法分别测定培养液中NO及ET1水平，用SABC免疫组化法观察细胞表面ICAM1的表达. 结果： 与对照组相比， 随着DHEA浓度的增加，培养液中NO的含量从(387±12)降至(242±11) μmol/L (P&<0.05)， 而ET1的浓度却从(397±13)增至(626±29) ng/L (P&<0.05). 随着时间的延长，各对照组培养液中NO含量均无明显变化（P&>0.05），而DHEA组NO生成量却逐渐降低(P&<0.05)，呈时间依赖. 培养液中ET1浓度无论是对照组还是DHEA组均随时间的延长而升高(P&<0.05），但DHEA组升高的更为明显. 无论是增加浓度还是延长时间， DHEA均不影响细胞表面ICAM1的表达. 结论： DHEA可通过调节内皮细胞NO及ET1生成量对血管功能进行调控.
【关键词】 脱氢表雄酮；ECV304细胞；一氧化氮；内皮缩血管肽1；胞间粘附分子1
0引言
血管内皮细胞的损伤及功能改变在动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)的发生中意义重大. 脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone， DHEA）是性激素合成过程的中间产物，主要由肾上腺皮质网状带分泌，是血浆中浓度最高的类固醇激素. 研究表明，DHEA可能是人体的一种内源性抗AS因子［1，2］，因而具有治疗及预防AS的应用前景. 但目前对其作用机制知之甚少. 我们采用培养的人脐静脉内皮细胞系ECV304，观察脱氢表雄酮对其一氧化氮（NO）、内皮素1（ET1）生成水平及细胞表面细胞间黏附分子1（ICAM1）表达的影响，以期从内皮细胞的角度说明DHEA的抗AS作用，并为从性激素稳态角度探讨男性内源性抗AS机制提供依据.
1材料和方法
1.1材料
ECV304人脐静脉内皮细胞系购自中科院协和基础研究所；RPMI1640培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶及DHEA均来自Sigma公司；NO含量试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ET1含量试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所，SABC免疫酶标试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，其他相关试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1细胞培养细胞经2 g/L胰蛋白酶与0.2 g/LEDTA的消化液消化后，用含100 mL/L新生小牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种在培养瓶内，置于50 mL/L CO2的培养箱中37℃培养，每2～3 d更换培养液，生长融合的细胞，经消化后进行传代培养.
1.2.2NO及ET1水平的测定生长良好的内皮细胞经消化后，以5×107个/L接种于放有盖玻片的12孔培养板，待细胞贴壁，弃去旧培养液，用无血清培养液冲洗2遍，加入各种实验用液， 继续培养相应时间后，收集上清，采用硝酸还原酶法测NO含量，放免法测ET1含量.
1.2.3细胞表面ICAM1的表达收集完上清，取出附着有细胞的盖玻片，PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛固定，按 SABC免疫酶标法进行. 细胞中呈现棕褐色或棕黑色颗粒者为阳性细胞，每张切片选取5个视野，计算200个细胞中的阳性细胞数，取其均值.
1.2.4实验分组
1.2.4.1不同浓度DHEA对内皮细胞功能的影响对照组为无血清培养基组， 实验组为含终浓度分别为1， 10， 100， 1000 nmol/L DHEA的无血清培养基组，作用时间为24 h.
1.2.4.2不同作用时间DHEA对内皮细胞功能的影响对照组为无血清培养基组， 实验组为加入终浓度10 nmol/L的DHEA，作用时间分别为12， 24和36 h.
统计学处理： 数据以x±s表示，SPSS11.0统计软件分析，不同浓度DHEA对内皮细胞功能影响的结果采用单因素方差分析；不同作用时间DHEA对内皮细胞功能影响的结果采用重复测量方差分析，P&<0.05为有统计学意义.
2.1不同浓度DHEA对内皮细胞功能的影响与对照组相比，DHEA可明显抑制细胞NO的合成，同时促进ET1的分泌(P&<0.05)，并呈浓度依赖. 但各种浓度的DHEA对细胞表面ICAM1的表达均无影响(Tab 1).表1不同浓度的DHEA对内皮细胞功能的影响（）略
2.2不同作用时间DHEA对内皮细胞功能的影响随着时间的延长，各对照组培养液中NO含量均无明显变化，而DHEA组NO生成量却逐渐降低 (P&<0.05)， 呈时间依赖. 培养液中ET1浓度无论是对照组还是DHEA组均随时间的延长而升高(P&<0.05），但DHEA组升高的更为明显. 各时段DHEA组与对照组细胞表面ICAM1的表达均较低，且无统计学意义(Tab 2).表2不同作用时间的DHEA对内皮细胞功能的影响（略）
3讨论
本实验结果表明，ET1的基础分泌量在12 h内较低，24及36 h后浓度逐渐增加，且DHEA组升高的更明显. 对照组培养液中NO含量不随时间的延长而变化，但DHEA组NO生成量却逐渐降低， 并呈时间依赖. 阮骊韬等［3］的研究结果也提示ET1的产生是一种累积过程. 由于体外实验没有清除ET1的场所，随着不断的分泌，培养液中ET1的浓度也将不断升高. 由于NO合成的减少可增加ET1的分泌. 因此，本实验中DHEA组的ET1较对照组高，很可能是由于DHEA一方面直接促进ET1的分泌；另一方面也可通过减少NO的合成，从而使NO抑制ET1分泌的作用减弱，最终导致培养液中ET1的含量逐渐增加. 但DHEA为何会抑制细胞NO的生成，本实验未作进一步探讨.
ET1主要由内皮细胞合成、释放，并以旁分泌的形式作用于附近的平滑肌细胞，引起平滑肌细胞的收缩和增殖. 而NO则可导致平滑肌的扩张及增殖受抑. 目前，关于ET1与NO间的相互关系及其在疾病发生中作用的具体机制仍不明确，推测二者之间可能存在反馈性调节. 在生理情况下，内皮细胞释放的舒张因子占优势，抑制血管的收缩和血小板的激活. 在病理情况下，ET1和NO释放失衡，收缩因子占优势. 但过多的NO生成又可因局部自由基的产生而造成组织损伤［4］. 由于内皮细胞上ICAM1表达的增多具有明显的促AS作用，而本实验结果表明DHEA不影响细胞ICAM1的表达. 因此，本实验结果似可解释为： DHEA通过对ET1分泌及NO合成的调节而间接影响血管平滑肌细胞的代谢及增殖，并与其他调节因子一起对生理条件下的血管功能进行调控.
对DHEA作用受体机制的研究还表明，由于DHEA在体内是性激素的前体物质，它可能转化为睾酮和雌激素而发挥其生物学效应［5］；DHEA的作用也可能通过直接与细胞上特异性位点相结合而引发，与其在外周组织的代谢、转化无关［6］. 我们的实验证实（资料未列出）DHEA也不大可能通过雌激素受体通路发挥其生物学效应.
参考文献
［1］ Bernini GP， SgroM， Moretti A， et al. Endogenous androgens and carotid intimalmedial thickness in women ［J］. J Clin Endocrinol Metab， 1999; 84(6): 2008-2012.
［2］ Okamoto K. Distribution of dehydroepiandrosterone sulfate and relationships between its level and serum lipid levels in a rural Japanese population ［J］. J Epidemiol， 1998; 8(5): 285-291.
［3］ 阮骊韬，曹铁生，段云友. 同型半胱氨酸对体外人脐静脉内皮细胞ET的影响［J］. 第四军医大学学报， 2002; 23(22): 封2.
Ruan LT， Cao TS， Duan YY， et al. The changes of ET in cultured HUVEC with Hcy in different concentration ［J］. J Fourth Mil Med Univ， 2002; 23(22): Cover 2.
［4］ Walia M， Kwan CY， Grover AK. Effects of free radicals on coronary artery ［J］. Med Princ Pract， 2003 ;12(1):1-9.
［5］ Hayashi T， Esaki T， Muto E， et al. Dehydroepiandrosterone retards atherosclerosis formation through its conversion to estrogen: The possible role of nitric oxide ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2000; 20(3): 782-792.
［6］ Furutama D， Fukui R， Amakawa M， et al. Inhibition of migration and proliferation of vascular smooth muscle cells by dehydroepiandrosterone sulfate ［J］. Biochim Biophys Acta， 1998; 1406(1): 107-114.