【摘要】 目的 为探索胆碱能神经元的胚胎来源，验证放射状胶质细胞是否表达乙酰胆碱转移酶。方法 通过对孕14天（E14）大鼠胚胎端脑冠状石蜡切片进行波形蛋白（放射状胶质细胞标志性蛋白，vimentin）和乙酰胆碱转移酶(胆碱能神经元的标志性蛋白ChAT)双重荧光免疫组织化学染色，并通过重叠同一视野内的荧光双染的图片来精确地体现放射状胶质细胞表达ChAT的位置。结果 E14大鼠端脑腹侧脑室区有部分组织呈vimentin/ChAT免疫化学双染阳性，这和资料中证实的胆碱能神经元E14天出现于第三脑室的腹背侧部的结论是一致的。结论 E14大鼠端脑内的放射状胶质细胞表达ChAT。表明放射状胶质细胞具有神经干细胞性质，它不断地进行不对称分裂，产生胆碱能表型的成神经细胞，即胆碱能前体细胞。
【关键词】 胆碱能神经元；放射状胶质细胞；乙酰胆碱转移酶；波形蛋白
Abstract:Objective To explore the embryonic source of cholinergic neurons and to verify whether the radial glial cells can express acetylcholine transferase.Methods Coronary paraffin sections of rat telencephalon on embryonic 14 days (E14) were prepared. Double fluorescent and immunohistochemical staining of vimentin (a protein marker of radial glial cell) and choline acetyltransferase (ChAT， a protein marker of cholinergic neuron) to test whether ChAT was expressed in the population of radial glial cell in vivo. Overlapped pictures in the same field of vision reflected the precise position where the radial glial cells expressed ChAT.Results Vimentin-positive cells coexpressed ChAT in ventral ganglionic eminence in E14 rats， which was consistent with the conclusion in previous reports that cholinergic neurons emerged in the dorsal or ventral side of the third ventricle on the E14 day.Conclusion In the E14 rat telencephal brain ChAT was expressed in the radial glial cell population. This result suggested that radial glial cells had the property of neural stem cells and continually underwent asymmetrical cell pision to generate neuronblasts with cholinergic phenotype， or cholinergic precursors.
Key words： cholinergic neuron; radial neuroglia cells; choline acetyltransferase; vimentin
胆碱能神经元是重要的功能神经元，广泛分布于中枢神经系统的脊髓、脑干、大脑皮质及基底神经核内。生物体的多种生理活动均有胆碱能神经元的参与，如学习和记忆、觉醒和睡眠、体温调节、摄食和饮水、感觉和运动、心血管活动的调节等［1］。因此，人体内的多种行为功能紊乱均涉及到胆碱能系统的功能失衡或病变。要彻底攻克这些相关疾病，首先要认识和了解胆碱能神经元的胚胎来源、发生机制等问题，只有了解了体内胆碱能神经元的发生、发育规律，才能有机会找到治疗此类疾病的有效途径。尽管目前对分布在大脑内的胆碱能神经元的时空定位已经明确，但是，对它们的来源仍然不清楚。有资料证实，在神经元发生期（大鼠为E12～18），脑室区内96％～98%的细胞均为放射状胶质细胞，可是放射状胶质细胞怎么会表达乙酰胆碱转移酶(ChAT)呢？以前的观点认为，放射状胶质细胞产生成神经细胞后，成神经细胞沿着其突起迁移，到达目的地方能表达其功能神经元表型［2-4］。我们推测端脑脑室区表达ChAT的有丝分裂细胞可能就是放射状胶质细胞，端脑中的胆碱能神经元可能来源于脑室区放射状胶质细胞。因此，我们拟通过E14大鼠端脑冠状切片观察放射状胶质细胞是否表达胆碱能神经元的标志性蛋白ChAT，为端脑胆碱能神经元可能来源于脑室区放射状胶质细胞这一判断寻找实验证据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂和主要仪器
兔抗大鼠ChAT抗体（多克隆），武汉博士德公司；小鼠抗大鼠波形蛋白（vimentin）抗体（单克隆），BioGenex；免疫组化SP染色试剂盒，福州迈新公司；TRITC-anti-rabbit IgG，北京中山试剂公司；FITC-anti-mouse IgG，北京中山试剂公司；YL3A型回转式石蜡切片机，德国Leika；病理组织漂烘处理仪，江苏常州中德电子仪器厂；荧光显微镜，日本Olympus。
1.1.2 实验动物
雌性健康Wistar 大鼠，体重(240±10) g，雄性健康Wistar大鼠，体重(300±10) g；由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。雌性与雄性Wistar 大鼠在下午5点以后以2∶1比例合笼交配，以次日清晨镜检查到阴栓或精子之日算为妊娠第0天（E0）。
1.2 方法
1.2.1 动物取材及石蜡切片标本制备
妊娠12～18天大鼠分别乙醚麻醉，灌流固定，取出胚胎后，迅速将胎脑置于Bouin′s固定液中2 h， 组织基本硬化后进行修块。然后继续固定6 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。
1.2.3 端脑冠状切片免疫荧光组化双重染色
取E14大鼠端脑石蜡包埋块进行冠状切片，预实验对ChAT免疫反应阳性细胞已进行定位切片，切片厚度为5 μm，置于60℃烤箱5 h。将切片脱蜡和水化，0.01％胰蛋白酶修复抗原，37℃，30 min；0.3%TritonX-100孵育RT 20 min；非免疫山羊血清封闭，RT，30 min； vimentin抗体与ChAT抗体混合稀释（两抗体效价均为1 ∶200），滴加2种混合一抗， 4℃过夜孵育；加入FITC-anti-mouse IgG（1∶100），RT， 45 min；滴加TRITC-anti-rabbit IgG（1∶100），RT， 45 min；除山羊血清封闭后无需漂洗外，以上每一步骤后均需0.01 mol/L PBS充分漂洗；最后防荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察，并拍照。
2 结果
2.1 端脑冠状切片免疫荧光组化双重染色
荧光显微镜下，激发光在蓝光波长范围时，vimentin 免疫反应阳性部位呈绿色荧光，显示放射状胶质细胞的双极长突起；激发光在绿色波长范围时，ChAT免疫反应阳性部位呈红色荧光，显示胆碱能前体细胞表型。在Photoshop软件支持下，把以上2张同一视野照片重叠，可见E14大鼠端脑侧神经节隆起存在vimentin和ChAT免疫反应双阳性细胞群（图1），两者共存的部位呈黄色荧光。
A.E14大鼠端脑脑室区冠状切面，框内所指区域为端脑腹侧（×100）；B.腹侧端脑脑室区细胞呈ChAT 免疫化学染色阳性（×400）；C.腹侧端脑脑室区细胞呈vimentin 免疫细胞化学染色阳性（×400）；D.腹侧端脑脑室区细胞呈vimentin/ChAT免疫化学双染阳性（×400）
3 讨论
在本课题组的前期实验中，我们采用免疫组织化学SABC法来证实在端脑切片中vimentin和ChAT在同一细胞中共存，但是，由于E14大鼠端脑细胞极小，其中核又占据整个细胞大约9/10的体积，表达在胞质中的2种蛋白很难用此方法辨认。因此，我们选择免疫荧光组织化学方法，即一种蛋白免疫反应后发出绿色荧光，另一种蛋白免疫反应后发出红色荧光，2种荧光叠加产生黄色荧光，此种方法可使2种共存的蛋白显而易见；从而增加了实验结果的可信度。
实验在E14大鼠端脑冠状切片中发现端脑腹侧侧神经节隆起脑室区存在vimentin和ChAT免疫反应双阳性细胞群。端脑腹侧侧神经节隆起是基底神经节中纹状体发生的原基，纹状体局部环路中间神经元和基底前脑系统的投射神经元均为胆碱能神经元，前者通过调节纹状体内的γ-氨基丁酸能投射神经元控制运动行为；后者的轴突投射到新皮质和海马参与认知功能。这两类胆碱能神经元来源于端脑腹侧，它们的迁移遵循着投射神经元放射状迁移到基底神经核，中间神经元切线式迁移到纹状体［5-7］。我们的实验结果提示，端脑腹侧侧神经节隆起脑室区的部分放射状胶质细胞可以产生胆碱能前体细胞。至于产生胆碱能前体细胞后如何进行迁移，尤其是胆碱能中间神经元的切线式迁移，还不清楚。然而，在实验中观察到，放射状胶质细胞的长突起不仅垂直于侧脑室分布，而且还有些远离脑室区的长突起平行于侧脑室形成弧形（资料没有显示），推测可能是胆碱能中间神经元仍然是沿着弧形的放射状胶质细胞长突起切线式迁移到目的地。但是，这与先前文献报道的切线式迁移是成神经细胞沿着轴突或其他神经元平行移动，即嗜神经细胞迁移不相吻合。其结论有待于进一步证实。
我们的实验资料还提示，端脑脑室区的放射状胶质细胞依据本身所处位置可能分为多种亚群，每一种亚群将产生不同类型的功能神经元。那么，是否所有区域分布的神经元均由放射状胶质细胞产生呢？在本课题组先前的实验中观察到，E14大鼠第三脑室的部分单层柱状室管膜细胞也表达ChAT，但不表达vimentin，这些表达ChAT的细胞逐渐增殖使局部上皮变为复层，深层的细胞迁移进入周围组织（资料没有显示）。所以，并不是所有区域的胆碱能神经元均来源于放射状胶质细胞。放射状胶质细胞的这种性质给神经干细胞的应用带来了极大的困难，它的异质性使分离的神经干细胞分化受到限制，而分离放射状胶质细胞亚群可能会有价值。但是，由于每一亚群细胞数量有限，不能满足其需求。总之，本实验的结果使我们理解了端脑发生区域性特化的深刻内涵，具有异质性的神经干细胞严格按照一定时空规律产生脑发育所需的不同细胞类型。这种机制可能取决于两方面：一是遗传所决定的端脑不同区域细胞群表达不同的同源域转录因子；二是不同区域细胞群所处微环境中细胞因子的诱导作用，两者相互作用调控神经元干细胞的增殖和分化。
参考文献
［1］Oda Y， Nakanishi I. The distribution of cholinergic neurons in the human central nervous system［J］. Histol Histopathol， 2000，15(3): 825-834.
［2］Schuurmans C， Guillemot F. Molecular mechanisms underlying cell fate specification in the developing telencephalon ［J］. Curr Opin Neurobiol，2002，12(1):26-34.
［3］Rosenwasser AM. Functional neuroanatomy of sleep and circadian rhythms［J］. Brain Res Rev，2009，61(2):281-306.
［4］Woolf NJ. A possible role for cholinergic neurons of the basal forebrain and pontomesencephalon in consciousness ［J］. Conscious Cogn， 1997，6(4): 574-596.
［5］Parnavelas JG， Nadarajah B. Radial glial cells: are they really glia ［J］. Neuron， 2001，27(31):881-884.
［6］Alvarez-Buylla A， Garcia-Verdugo JM， Tramontin AD. A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells ［J］. Nat Rev Neurosci， 2001，2 (4):287-293.
［7］Noctor SC， Flint AC， Weissman TA， et al. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex ［J］. Nature. 2001，409(6821):714-720.