【摘要】 目的 通过与传统的结核病实验室诊断方法（直接涂片抗酸染色、改良罗氏培养、PCR）的比较，评价免疫胶体金法检测结核杆菌MPB64抗原在结核病快速诊断中的应用价值。方法 收集158例确诊为结核病患者的临床标本，分别用直接涂片抗酸染色、改良罗氏培养基培养、PCR、免疫胶体金法检测米氏7H9培养产物中的MPB64抗原检测结核分支杆菌，并对结果进行比较分析。结果 涂片阳性率为10.76%，改良罗氏培养阳性率为20.89%，PCR检测阳性率为56.33%，免疫胶体金法检测阳性率为41.14％。结论 免疫胶体金法检测米氏7H9液体培养产物中的MPB64抗原可以作为一种较为敏感、快速简便的检测结核分支杆菌感染的方法，有助于结核病临床快速诊断。
【关键词】 MPB64抗原；结核病；快速诊断
结核病的控制关键在于早发现和早治疗，而结核病细菌学检查是临床上明确结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核和评价疗效的可靠标准。结核病的确诊和治疗方案很大程度上依赖于结核分支杆菌的实验室检查，快速、准确的结核分支杆菌的检测对于结核病的快速诊断，乃至对结核病的防治，都有着极其重要的意义。近年来可以作为结核杆菌存在直接证据的结核特异性外分泌抗原如Ag85、ESAT－6、CFP10、MPB64等的检测越来越受到关注，其中MPB64是较为令人注目的一种［1-4］。本研究收集了158例确诊为结核病的临床标本，分别用直接涂片抗酸染色、改良罗氏培养基培养、DNA PCR检测、免疫胶体金法检测米氏7H9培养产物中的MPB64抗原（以下简称MPB64抗原检测）检测结核分支杆菌，并对结果进行比较分析，以评价MPB64抗原检测在结核病快速诊断中的应用价值。
1 资料和方法
1.1 对象
选取2007年1月—2008年12月依据《中华人民共和国传染病防治法》规定管理的传染病诊断标准（试行）中的结核病诊断标准，确诊为结核病的本院及淮安市第四人民医院住院和门诊患者158例，收集标本158份。其中男性91例，女性67例，年龄13～78岁，平均年龄32.3岁。肺结核124例，结核性胸膜炎30例，结核性关节炎3例，结核性脑膜炎1例。收集到的标本分别为痰124份，胸腔积液30份，关节穿刺物3份，脑脊液1份。另外，于同一时期收集50例临床已排除结核病的呼吸道感染患者的痰液标本50份作为对照组。
1.2 材料
抗酸染液和改良酸性罗氏培养基等材料为本院实验室参照全国结核病细菌学检验规程自配，7H9液体培养基及结核菌胶体金检测试剂盒均购自杭州创新生物检控技术有限公司，7H9液体培养基批号为071215、080524、090122，结核菌胶体金检测试剂盒批号为070501、081104、090108。DNA PCR检测采用的设备为罗氏lightcycler2.0，试剂为中山大学达安基因股份有限公司生产的结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂，批号为200705、200806、200812、200902。不能及时检测的标本，将留置容器严格密封后，置于4℃冰箱保存，并在其上应注明患者姓名、编号及日期 。
1.3 方法
1.3.1 标本收集和前处理
1.3.1.1 痰标本
肺结核患者在治疗前收集痰标本，每个病例按规定收集痰液，痰液总量不少于20 ml。除部分用于直接涂片染色外，其他痰标本作如下前处理：在容器中加入适量4%NaOH，用无菌玻棒持续搅拌，痰液充分消化后，吸取0.2 ml消化后痰液另放用于改良罗氏培养；其余的消化后痰液进行中和处理，标本移至50 ml离心管（量多者分多管），3 000 g离心15 min，倾去上清，再加入20～30 ml pH值为6.8的PBS中和，再以3 000 g离心，倾倒去上清，上述中和、离心（必要时可重复1次或多次PBS中和）所得沉淀物测试pH值为7.0～7.2后用于米氏7H9培养基培养。
1.3.1.2 胸腔积液、脑脊液、关节腔积液
以无菌容器收集临床穿刺所得的积液，除部分用于直接涂片染色检测外，经3 000 g离心15 min后，倾倒去上清得到沉淀，加入2 ml生理盐水混匀备用。
1.3.2 直接涂片抗酸染色
具体操作步骤和判读标准均参照《全国结核病细菌学检验规程》。
1.3.3 改良罗氏培养和米氏7H9培养
1.3.3.1 改良罗氏培养
吸取0.1 ml标本均匀地接种于改良酸性罗氏培养基斜面，放入37℃孵箱中进行培养，观察并记录斜面长菌情况。
1.3.3.2 米氏7H9培养
吸取1 ml左右标本接种于含有5 ml米氏7H9液体培养基的培养管中，放入37℃孵箱中进行培养。所有培养管自第2天开始，每天观察1次，并取其培养液进行MPB64抗原检测，阳性者培养管另存备用，阴性者继续培养观察，直至第30天检测结果仍为阴性者报告为阴性。若培养基在培养箱中很快（1～3天）出现混浊，或有大量快速增加的沉淀物，应考虑培养基污染。
1.3.4 DNA PCR检测
按厂家提供的试剂和仪器操作说明书操作并报告结果。
1.3.5 MPB64抗原检测
经7H9液体培养基培养后（7～15天），将培养液混匀，吸取150 μl 培养液加入MPB64结核菌胶体金检测卡的检测孔中，15 min后观察结果。结果判定:检测区和控制区均出现紫红色条带为阳性，在控制区出现紫红色条带、检测区未出现为阴性结果。控制区未出现任何条带需重新检测。
2 结果
2.1 4种检测方法阳性率比较
158份标本4种方法检测阳性率及特异性比较见表1。表1 4种方法检测结核杆菌阳性率比较（略）
2.2 肺结核和各肺外结核标本检测结果比较见表2。表2 肺结核和肺外结核标本检测阳性率比较（略）
3例关节穿刺物标本中，2例为改良罗氏培养和MPB64抗原检测2种方法检测同为阳性，1例为改良罗氏培养、DNA PCR、MPB64抗原检测3种方法检测同为阳性，而仅有的1例脑脊液标本4种方法检测均为阳性。
2.3 MPB64抗原检测阳性结果报告时间见表3。表3 65例MPB64抗原检测阳性结果报告时间（略）
2.4 痰标本MPB64抗原检测与涂片抗酸染色和改良罗氏培养阳性率的比较 见表4。其中，改良罗氏培养阳性而MPB64抗原检测为阴性的4例标本菌株后经对硝基苯甲酸（PNB）生长试验鉴别，鉴定为非结核分支杆菌。表4 124例痰标本MPB64抗原检测与涂片抗酸染色和改良罗氏培养的比较（略）
3 讨论
MPB64（也称MPT64）蛋白是结核分支杆菌在生长繁殖中分泌的分子量为24 kD的一种有特殊作用的外分泌蛋白，可导致强烈的迟发型超敏反应。MPB64蛋白主要存在于结核分支杆菌复合菌群，M.flavescens为弱阳性，而非结核分支杆菌极少出现阳性，因此有很强的特异性［5-6］。张嵘等［7］曾报道用免疫色谱法抗-MPB64单克隆抗体检测和快速诊断结核分支杆菌结核菌群，能特异性地鉴别结核和非结核分支杆菌。Hillemann等［8］用Capilia TB产品检测MPB64抗原，在172例结核杆菌阳性的临床标本的检测中，阳性检出率为92%，特异性达到100%。本实验中改良罗氏培养阳性而MPB64抗原检测为阴性的4例标本菌株后经PNB生长试验鉴定为非结核分支杆菌，这一实验结果支持他们的研究结果。本次研究结果显示，4种结核杆菌实验室检测方法中，结核杆菌DNA PCR检测最敏感、快速，但此法在阴性对照组中也有3例检出阳性，可能为假阳性;但也不能排除3份标本存在微量结核分支杆菌，由于PCR检测灵敏度很高，因此仍能被检出的可能性。不管属于哪种情况，其阳性结果对临床诊断有一定的诱导作用。而传统的直接涂片抗酸染色镜检阳性检出率（10.76%）明显比其他3种方法低，改良罗氏培养的检出率（20.89%）虽然比涂片镜检有所提高，但明显低于MPB64抗原检测的41.14%，且耗时更长。相对于涂片和改良罗氏培养，MPB64抗原检测在报告时间、阳性检出率等方面均体现出较大的优势。但是从实验可操作性方面来讲，每天都要吸取150 μl用于检测很可能会影响后面的培养效能，增加污染机会，另外每天消耗一张检测卡也会大大地增加成本，不过MPB64检测阳性的出现时间绝大多数集中在培养6～14天时，因此如果此法用于临床检测，建议可在培养7天开始作MPB64抗原检测，检测结果阳性可直接报告结核分支杆菌检测阳性，检测结果为阴性者，待培养至第15天再作MPB64抗原检测，如果此时检测结果仍为阴性，基本上可以报告结核分支杆菌检测阴性，临床高度怀疑结核病的标本，可继续培养至30天再作MPB64抗原检测。这样可以提高MPB64抗原检测的可操作性，并大大降低成本。
综上所述，免疫胶体金法检测米氏7H9培养产物中的MPB64相对具备了快速、经济、操作方便、无须大型仪器投入等多种优点，在基层医院结核病诊断中有较大的应用价值。
参考文献
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［8］Hillemann D， Rüsch-Gerdes S， Richter E. Application of the Capilia TB assay for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex isolates ［J］. Int J Tuberc Lung Dis，2005，9(12):1409-1411.