作者：刘晓东， 曹长春， 武煜， 陈宇
【摘要】 目的 通过建立大鼠肾脏急性缺血/再灌注(I/R)及缺血预适应 (I/P+I/R)模型，初步研究不同的缺血方式后肾脏核因子-κB（NF-κB）活性及二聚体亚单位的构成，探讨其减轻肾脏肾小管细胞凋亡的机制。方法 30只雄性SD大鼠摘除右肾、分离出左肾动脉后随机均分为3组（n=10）：A组为假手术组（Sham组），只分离左肾动脉，暴露术野60 min后直接缝合，24 h后取肾；B组为缺血/再灌注组(I/R组)，持续夹闭左肾动脉45 min，恢复血供24 h后取肾；C组为缺血预适应+缺血/再灌注组(I/P+I/R组)，左肾动脉夹闭2 min，松开5 min，重复3个循环，余同I/R组。分别用生化学方法检测血肌酐值的变化，组织病理学评价肾小管损伤程度评分，凝胶电泳迟滞分析检测肾组织NF-κB/DNA 结合活性，超迟滞分析检测NF-κB亚单位的构成，Tunel法检测肾小管上皮细胞的凋亡。结果 血清学检查及肾小管损伤评分提示，I/R组肾脏组织病理改变明显，损伤程度重，与Sham组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组比较，I/P+I/R组损伤程度则明显减轻，差异有统计学意义（P<0.05）。凝胶电泳迟滞分析检测肾组织NF-κB/DNA结合活性I/P+I/R组明显高于Sham组，差异有统计学意义 (P<0.05)；超迟滞分析检测NF-κB亚单位含有p65、p50；差异有统计学意义(P<0.05)。结论 肾脏缺血预适应可通过抑制NF-κB转录活性，减轻肾小管上皮细胞凋亡，从而发挥损伤保护效应。
【关键词】 肾脏；缺血预适应；核因子-κB；细胞凋亡
Abstract: Objective To investigate the effect of different modes of renal ischemia on the activity of NF-κB and the composition of dimeric subunit and to explore the causative mechanism underlying the attenuated apoptosis of renal tubular cells with the establishment of animal models of acute renal ischemic/reperfusion (I/R) and ischemic preconditioning (I/P+I/R) in rats. Methods 30 male Sprague-Dawley rats were randomized into 3 groups (n=10 each) following right nephrectomy and isolation of the left renal artery. Group A served as the sham-operated control， only with isolation of the left renal artery and suture following exposure for 60 min. Group B (I/R group) rats were subjected to ischemia for 45 min by clamping of the left renal artery and subsequent resumed blood supply. Group C (I/P+I/R) rats were pre-treated with 3 cycles of 2-minute ischemia and 5-minute reperfusion. All the rats were sacrificed at 24 h and nephrectomy was performed for analysis， including biochemical determination of the serum creatinine， histopathological evaluation of the renal tubules， electrophoretic mobility shift assay (EMSA) of renal NF-кB/DNA binding activity， super shift assay of the composition of NF-κB complexes in renal tissues and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay of the apoptosis of renal tubular epithelial cells. Results Serological examinations and scores of renal tubular injury revealed evident histopatological changes and serious injury in renal tissues in group B. Compared with the sham group， the differences were statistically significant (P<0.05); Compared with group B， group C had markedly attenuated injury with significant statistical differences (P<0.05); EMSA results showed that the renal NF-кB/DNA binding activity was significantly higher in group C than in group A， with significant statistical differences (P<0.05); and super shift assay of the composition of NF-κB dimeric subunit confirmed the presence of p65 and p50 in group C， with significant statistical differences (P<0.05). Conclusion Renal ischemic preconditioning attenuates the apoptosis of renal tubular epithelial cells via the inhibition of the transcriptional activity of NF-кB， and thus has the protective effect on renal tissues.
Key words: kidney; ischemic preconditioning; nuclear factor-кB; apoptosis
缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）是指脏器短暂缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）后能耐受更长时间的缺血，其内在的分子生物学机制尚未明了［1］。我们的前期研究表明，大鼠肾脏也存在缺血预适应的现象，具有一定的肾脏保护作用［2］。已有研究发现，细胞凋亡可能是缺血/再灌损伤的重要环节之一，而核因子-κB（NF-κB）是调控细胞凋亡的关键转录因子，可调控多种抗凋亡和促凋亡基因的转录［3］。但对于肾脏缺血预适应的抗凋亡作用及胞内NF-κB信号转导通路的活化特点尚未阐明。为此，本实验通过观察肾脏缺血预适应对NF-κB转录活性及细胞凋亡的影响，探讨肾脏缺血预适应的抗凋亡机制，为肾脏缺血/再灌注损伤的防治提供重要的理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物选择与分组
健康雄性SD大鼠30只，体重240～250 g，由南京医科大学实验动物中心提供。3%戊巴比妥钠麻醉后，所有动物均摘除右肾，稳定10 min；随机分成3组：A组为假手术组(Sham组，n=10)，只分离左肾动脉，暴露术野60 min后直接缝合，24 h后取材;B组为缺血/再灌注组(I/R组，n=10)持续夹闭左肾动脉45 min，恢复血供24 h后取材；C组为缺血预适应+缺血/再灌注组(I/P+I/R组，n=10)，左肾动脉夹闭2 min，松开5 min，重复3个循环，余同I/R组。
1.2 血清学检查
大鼠腔静脉采血1 ml，立即用离心机3 000 r/min离心5 min，取上清液进行血肌酐值测定。
1.3 组织学检查
常规石蜡切片进行苏木精-伊红染色，光镜下观察其结构变化，对肾小管坏死程度进行评分。评分标准：每张切片在400倍镜下取外髓质部10个视野，依序观察左上、右上、左下、右下、中间。正常为0分，轻微损伤（受损肾小管< 5%）为1分，轻度损伤（受损肾小管5%～25%）为2分，中度损伤（受损肾小管25%～75%）为3分，重度损伤（受损肾小管> 75%）为4分；以此作半定量分析并计算其平均值，作为肾小管坏死的标准评分指数［4］。
1.4 凝胶电泳迟滞分析(EMSA)测定NF-κB/DNA结合活性
提取肾组织核蛋白，以微量考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度，调至2 g/L，并于-70 ℃保存。按试剂盒(Promega 公司)说明进行：在T4激酶作用下，将γ-32P-ATP (北京亚辉公司) 标记到NF-κB位点ODN(探针)上后纯化。将核蛋白抽提物与标记的NF-κB 探针反应，同时做特异性竞争结合试验。超迟滞分析（super shift assay）部分：将2 μl抗NF-κB亚单位抗体p65、p50、Rel-B、p52分别在加入探针前加入反应体系，室温孵育30 min，反应产物经4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳完毕后，- 70 ℃放射性自显影，X线胶片上的滞后带用凝胶成像分析系统进行分析。以相对密度单位(RDU) 表示NF-κB/DNA 结合活性。
1.5 原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)测定肾小管上皮细胞凋亡
试剂盒由南京凯基生物公司提供。切片厚5 μm，常规脱蜡入水，经3％过氧化氢室温处理10 min以消除内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗3次，蛋白酶K消化30 min，然后用PBS缓冲液冲洗3次，加入TUNEL的反应液37℃孵育60 min，用PBS缓冲液冲洗3次后加亲和素辣根过氧化物酶，37℃湿盒孵育30 min，PBS缓冲液冲洗3次，加DAB试剂显色，苏木精染色，脱水、透明、封片。光镜下观察凋亡细胞，细胞核呈棕黄色者为阳性细胞，于凋亡细胞分布区域，随机选取5个视野，用400倍光镜计数凋亡细胞，以肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数占总肾小管上皮细胞数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)。
1.6 统计学处理
所有数据均以±s表示，各组间检验用方差分析(F检验和q检验)。所有数据使用SPSS 11.0 统计软件进行分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血肌酐的变化
I/R组和I/P+I/R组大鼠血肌酐值与Sham组比较都有明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01），但是I/P+I/R组血肌酐值明显低于I/R组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 各组大鼠血肌酐、肾小管损伤积分及AI的比较（略）
2.2 各组大鼠肾小管损伤积分的变化
I/R组肾脏组织病理改变明显，受损最严重的部位是皮髓交界处、外髓内带的近端小管，主要表现为小管上皮细胞脱落、刷状缘消失和肾小管阻塞。与I/R组比较，I/P+I/R组损伤程度则明显减轻，肾小管损伤积分明显减少（P<0.05）见图1、表1。
2.3 各组大鼠肾组织NF-κB/DNA结合活性的变化
检测结果表明实验组的NF-κB/DNA结合活性明显高于Sham组（2.24±0.15 vs. 0.69±0.22，1.25±0.20 vs. 0.69±0.22)，差异具有统计学意义（P<0.01）。I/R+I/P组的NF-κB/DNA结合活性较I/R组明显减少(1.25±0.20 vs. 2.24±0.15)，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图2。这说明肾脏缺血预适应能够抑制I/P+I/R组NF-κB/DNA结合活性。
2.4 凝胶电泳超迟滞分析检测I/P+I/R组NF-κB二聚体的构成
检测结果表明I/P+I/R组NF-κB二聚体亚基含有p65和p50，不含有p52和Rel-B，见图3。这提示肾脏缺血预适应激活了NF-κB经典途径，可能不通过非经典途径而发挥保护作用。
2.5 各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡情况的比较
Sham组偶见凋亡的细胞，见图4B；I/R组和I/P+I/R组凋亡的细胞数明显增减加，见图4C、D；与Sham组比较，再灌注24 h后，I/R组和I/P+I/R组凋亡的细胞数明显增减加，差异具有统计学意义（P<0.01），见表1；与I/R组比较，I/P+I/R组凋亡的细胞数减少，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。
3 讨论
缺血/再灌注损伤是指缺血期处于可逆损伤的细胞经恢复血液供应后转化为不可逆损伤，凋亡越来越被认为是缺血/再灌注时细胞死亡的重要机制之一。而缺血/再灌注损伤造成细胞凋亡的机制的非常复杂。近年来，随着分子生物学的进展，越来越多的证据表明NF-κB在细胞凋亡中的关键作用，早期活化的NF-κB通过促进凋亡抑制基因的转录，抑制促凋亡基因表达，能够保护组织细胞免于凋亡，而后期活化则使细胞凋亡加重［3， 5-7］。我们在先前的实验中证实了大鼠肾脏存在缺血预适应的现象，同肾脏直接、持续性缺血相比，预缺血活化的NF-κB高峰提早，可以保护肾脏免受随后持续性缺血所引起的损伤作用。当应用NF-κB特异性抑制剂处理以后，该保护作用消失［2， 8］。因此本研究采用夹闭左肾动脉，缺血2 min/再灌注5 min重复3次的方法来诱导缺血预适应，可以使NF-κB早期活化，从而发挥肾脏保护作用。
以往的传统观点认为NF-κB的活化主要是促进炎症因子的释放；随着研究的深入，发现NF-κB的作用具有两面性。在炎症的不同阶段，NF-κB的作用不同甚至相反；可能与其活化的方式、二聚体的组成从而调控不同的基因有关［9-10］。本研究结果表明：同肾脏直接、持续性缺血相比，缺血预适应可以明显抑制NF-κB的活性，从而减轻了预处理组的肾小管上皮细胞的凋亡。虽然I/R组和I/P+I/R组都激活了NF-κB的活性，但两组大鼠不同的预后提示: NF-κB可能是处于细胞生存与凋亡的调节点，由于NF-κB的靶基因上存在众多功能性的κB结合位点，推测可能与下调促凋亡因子的基因表达，或者通过上调抗凋亡基因的表达而发挥抗凋亡作用有关。至于具体诱导那些基因，则有待于进一步研究。
目前主要存在两条NF-κB激活途径：一条是经典途径，与先天性免疫有关，在该途径中此时活化的NF-κB二聚体以p65/p50为主［11-12］；另外一条为可替代途径，其活化的NF-κB二聚体以Rel-B/p52为主，主要与适应性免疫功能有关［13］。本研究发现缺血预适应组激活的NF-κB亚单位含有p65、p50，提示缺血预适应组激活了经典途径。本实验尚未发现可替代途径的激活，推测是由于本次研究的动物模型是肾脏急性缺血/再灌注损伤模型，而可替代途径的激活需要较长时间，其主要作用是参与淋巴器官发育和B细胞成熟以及促进骨骼和皮肤的分化发育。
综合上述，肾脏缺血预适应可减轻缺血/再灌注损伤，其机制与抑制NF-κB活性和减轻肾小管上皮细胞凋亡有关。
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，杨晶，范丽，尹忠诚