【摘要】 目的 探讨大蒜素(diallyl trisulfide， allicin)对人胃癌细胞株SGC7901体外生长的影响。方法 大蒜素处理胃癌细胞株SGC7901，MTT法检测SGC7901的生长，流式细胞仪检测细胞凋亡率，免疫细胞化学法检测Ki67的表达。结果 大蒜素作用于SGC7901细胞后，对其增殖表现出了明显的抑制作用，且呈浓度依赖性;大蒜素作用于SGC7901细胞12、24和48 h后，细胞凋亡率分别为2.41%、7.30%和15.44%，明显高于对照组(P<0.05);大蒜素作用48h后，Ki67的阳性表达率下降(P<0.05)。结论 大蒜素可以抑制胃癌SGC7901细胞的增殖和诱导细胞凋亡。
【关键词】 大蒜素;胃癌细胞;增殖;凋亡
Abstract： Objective To investigate the effects of allicin on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell line SGC7901. Methods The SGC7901 cells were treated by allicin， and MTT assay was used to determine the cell growth. The apoptosis of SGC7901 was detected by flow cytometry (FCM). The expression of Ki67 in gastric cancer cells was detected by immunohistochemical staining. Results Allicin effectively inhibited the growth of SGC7901 gastric cancer cells in a concentration-dependent manner at a certain range of concentrations. The inhibitory rate was significantly higher than control group. 12h， 24h and 48h after allicin treatment， the apoptosis rate was 2.41%， 7.30% and 15.44%， respectively， with significantly higher effects as compared to the control group (P<0.05). The expression of Ki67 protein was down-regulated by allicin compared with the control group (P<0.05). Conclusion Allicin could inhibit the proliferation and induce apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells.
Key words： allicin; gastric tumor cell; proliferation; apoptosis
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。以化疗为主的综合治疗是晚期胃癌的主要治疗手段，常用的化疗药物大多既能杀伤肿瘤细胞，又能损伤正常的组织细胞，从而对胃癌患者的总体生存期并无明显改善。因此，在肿瘤化疗过程中对肿瘤细胞最大限度的杀伤，而对正常细胞毒性最低的药物研发越来越引起重视。大蒜素是从大蒜球茎中分离出的一种油状液体，主要成分为二烯丙基三硫，是大蒜素发挥抗癌活性的主要物质[1-2]。研究证明大蒜有良好的防癌、抗癌作用[3]。本实验将大蒜素作用于人胃癌细胞SGC-7901，研究大蒜素对肿瘤细胞的杀伤作用。
1 材料和方法
1.1 材料 胃癌细胞株SGC7901(中国科学院细胞生物研究所)，大蒜素注射液(上海禾丰制药有限公司)，Ki67抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体(Santa Cruz公司)，RPMI 1640 (Invitriogen公司)，小牛血清(杭州四季青公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人胃癌细胞株SGC7901用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2的饱和湿度条件下培养。
1.2.2 MTT 法检测细胞抑制率 取处于对数生长期的胃癌SGC7901细胞，常规胰酶消化后制成单细胞悬液，使细胞密度为(4～5)×107/L;将细胞接种于96孔板中，每孔0.1 ml， 在37℃、5%CO2的饱和湿度条件下培养24 h，分别加入0、3、6、12、24 mg/L的大蒜素，继续培养48 h，随后每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，继续培养4 h，倾尽上清。每孔加入二甲基亚砜0.1 ml，摇床上摇动约15 min以充分溶解，用酶标仪在波长570 nm处检测各孔光密度值(D值)，计算细胞生长抑制率。每组实验重复6次。细胞生长抑制率=(1-实验组平均D值)/空白对照组平均D值×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 大蒜素(3 mg/L)作用于胃癌SGC7901细胞12、24和48 h后收集细胞，将收获的各组细胞制成单细胞悬液，加入预冷的70%冰乙醇，-20℃内固定24 h，加RNA酶(终浓度为50 mg/L)37℃反应1 h，再加入碘化丙啶溶液(质量浓度100 mg/L)避光染色30 min后，在流式细胞仪上检测胃癌SGC7901细胞的凋亡率。每组实验重复5次。
1.2.4 免疫细胞化学法检测Ki67蛋白的表达 胃癌SGC7901细胞的单细胞悬液制备同1.2.2方法，将细胞接种于预先放置盖玻片的24孔板中，放入培养箱中继续培养24 h，弃去培养液，加入含大蒜素(3 mg/L)培养液继续培养48 h，弃去培养液，用PBS冲洗3次，取出盖玻片，放入冷丙酮中固定20 min。免疫细胞化学染色严格按SP试剂盒操作说明书进行。Ki67蛋白的阳性表达表现为细胞核出现黄色或棕色颗粒。每一个玻片随机选取5个高倍视野(×400)，在每个视野下随机观察200个细胞，计算细胞阳性率。并取5个玻片的平均值。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行数据处理。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大蒜素对胃癌SGC7901细胞的抑制作用 对照组细胞呈正常的对数生长，实验组细胞随大蒜素药物浓度提高，细胞生长抑制率呈上升趋势，呈浓度依赖性(P<0.05，表1)。大蒜素的IC50值为(20.25±1.98)mg/L。表1 大蒜素抑制胃癌SGC7901细胞生长的作用
2.2 大蒜素对胃癌SGC7901细胞凋亡的诱导作用 大蒜素(3 mg/L)处理胃癌SGC7901细胞12、24和48 h后，细胞凋亡率均明显高于空白对照组(P<0.05，表2)。
2.3 大蒜素对胃癌SGC7901细胞Ki67蛋白表达的影响 大蒜素(3 mg/L)作用于胃癌SGC7901细胞48 h后，Ki67蛋白的阳性表达率下降。与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05，表3)。表2 大蒜素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用(n=5，±s，%)表3 大蒜素作用胃癌SGC7901细胞Ki67蛋白的阳性表达率(n=5，±s)
3 讨 论
大蒜是百合科葱属植物的鳞茎，目前认为大蒜中主要的生物活性物质是大蒜所特有的含硫化合物，其中最重要的是二烯丙基三硫，又名大蒜素(分子式为C6H10S3)，临床除抗菌消炎外，也可抑制肿瘤生长，如大蒜素可有效抑制人前列腺癌[4]、结肠癌HT-29细胞[5]、胃癌SGC7901细胞[6]等的增殖。大蒜素能有效抑制乳腺组织代谢中己烯雌酚所导致细胞基因的不稳定和癌变[7]。目前的研究结果己证实，大蒜素可以抑制多种体外癌细胞的生长，但其机制却不十分明确。有研究证实，大蒜素能通过激活caspase-3、caspase-8和caspase-9的信号的活动诱导人癌细胞凋亡小体形成，核浓缩和典型的DAN梯形带形成[8]。大蒜素诱导的前列腺癌细胞株PC-3和DU-145凋亡是通过活化caspase-3和caspase-9来实现的，同时还发现caspase抑制剂能够抑制大蒜素诱导的前列腺癌细胞株的凋亡[9]。
本实验采用不同浓度的大蒜素作用于人胃癌SGC7901细胞后，细胞增殖抑制率测定结果显示肿瘤细胞生长受到明显抑制，且呈浓度依赖性。以低浓度大蒜素作用于人胃癌SGC7901细胞，即可诱导细胞发生凋亡，12、24和48 h细胞凋亡率可达2.41%、7.30%和15.44%，均明显明显高于对照组。免疫细胞化学法证实反映胃癌细胞增殖的Ki67蛋白的表达也发生相应的改变：低浓度大蒜素组胃癌SGC7901细胞中Ki67蛋白的表达降低，提示胃癌细胞的增殖能力下降，进一步说明大蒜素可抑制肿瘤细胞的增殖。
综上所述，大蒜素对胃癌细胞增殖抑制作用明显，可以诱导细胞凋亡。与其他化疗药物相比，毒副作用小，是一种很有潜力的化学预防剂，深入研究其作用的分子机制，具有十分重要的理论意义和广泛的应用前景。
参考文献
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