作者：王鹏，王厚清，程江华，陈晓兵，许铁
【摘要】 目的 研究亚甲蓝(methylene blue，MB)对创伤性休克兔肾脏的保护作用及其可能机制。方法 选用健康日本长耳大白兔18只，随机分为对照组(CON组)、生理盐水复苏组(NS组)、MB处理组(MB组)，每组6只。NS组及MB组观察休克前(T1)、休克末(T2)、复苏末(T3)及复苏后2 h(T4)、4 h(T5)、6 h(T6)、8 h(T7)时间点平均动脉压(MAP)的动态变化，测定各时间点血浆尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。观察各组兔肾组织光镜下病理形态学变化。结果 NS组复苏末及复苏后各时间点MAP均未达到基础值水平(P<0.05);复苏末及复苏后各时间点MAP与CON组比较差异有统计学意义(P<0.05);复苏后2 h、6 h、8 h的MAP与MB组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MB组休克末及复苏后2 h MAP与基础值比较差异有统计学意义(P<0.05)，与CON组比较差异有统计学意义(P<0.05)。兔创伤性休克复苏后各时间点NS组、MB组BUN、Cr水平较CON组升高(P<0.05)，但MB组BUN、Cr水平较NS组明显降低(P<0.05)。光镜下NS组和MB组肾脏可见轻微的病理改变，但两组之间无明显差异，较对照组亦无明显改变。结论 创伤性休克可致兔肾功能损害，MB能显著改善休克后兔血流动力学、肾功能，保护肾脏组织。
【关键词】 创伤性休克;亚甲蓝;尿素氮;肌酐;平均动脉压
Abstract： Objective To study the protective effect of methylene blue (MB) on the kidneys in rabbits with traumatic shock and the potential mechanism. Methods 18 Japanese rabbits were randomized into 3 groups (n=6 each): control group (CON group)， resuscitation with normal saline group (NS group) and methylene blue group (MB group). In NS group and MB group， the dynamic variations of mean arterial pressure (MAP) at different time points was recorded， i.e.， before shock (T1)， at the end of shock (T2)， at the end of resuscitation (T3)， 2 h (T4)， 4 h (T5)， 6 h (T6) and 8 h (T7) after resuscitation， and the level of blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (Cr) in the plasma at each time points was determined. Tissue samples of the kidney obtained from experiments were observed for pathomorphological changes under the light microscope. Results In NS group， the MAP level at the end of resuscitation and at each time point after resuscitation did not reach the basal value (P<0.05); and the MAP level at these time points had significant statistical difference as compare to CON group (P<0.05); the MAP levels at T4， T6 and T7 had significant statistical difference vs. MP group (P<0.05). In MB group， the MAP level at T2 and T4 had statistical difference vs. the basal value (P<0.05) and vs. CON group (P<0.05). In the NS and MB groups， the level of plasma BUN and Cr markedly increased， compared with that in CON group (P<0.05)， while the level of BUN and Cr was obviously lower in MB group than that in NS group (P<0.05). Light microscopy revealed slight pathological changes in kidney tissues in NS and MB groups， but the differences were not significant between NS and MB groups and among the 3 groups. Conclusion The kidney function of rabbits could be vulnerable to traumatic shock. MB can notably ameliorate the hemodynamics and function of the kidney in rabbits with traumatic shock and protect the renal tissues.
Key words: traumatic shock; methylene blue; blood urea nitrogen; creatinine; mean arterial pressure
创伤性休克是临床上常见的休克类型，是导致多器官功能障碍综合征(MODS)的重要原因之一。低血压休克致肾脏血管收缩，血流减少，持续的低血压会使细胞能量减少，尿液不能浓缩，导致肾小管上皮坏死和肾功能衰竭[1]。本实验采用Lamson′s法建立创伤性休克动物模型，观察创伤性休克兔复苏后及亚甲蓝(methylene blue， MB)干预后血流动力学、血浆尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)水平的变化，探讨MB对创伤性休克肾损伤的保护作用，为临床应用MB治疗创伤性休克肾损伤提供动物实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康日本长耳大白兔18只，由徐州医学院实验动物中心提供，许可证号： SCXK(苏)2007-0037，5～7月龄，雌雄各半，体重(2.70±0.22)kg。将实验动物随机分成3组：对照组(CON组)，创伤性休克生理盐水复苏组(NS组)，创伤性休克MB处理组(MB组)，每组6只。动物在实验前禁食12 h，禁水8 h。实验方案经徐州医学院动物伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和仪器 亚甲蓝(江苏济川制药有限公司)，低温离心机(TGL-16G型，日本SANYO公司)，BL420E+生物机能实验系统(成都泰能仪器有限公司)，BUN、Cr试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 模型制作及复苏方法 采用Lamson′s法建立创伤性休克动物模型。3%戊巴比妥钠溶液30 mg/kg经耳缘静脉注射麻醉后，将兔仰卧并固定于兔台，行右侧颈动脉、股动脉插管术，经耳缘静脉注射肝素(6 mg/kg)将兔全身肝素化，股动脉导管接换能器与BL420E+生物机能实验系统连接，监测平均动脉压(MAP);颈动脉插管用于放血和采取血液标本。上述手术完成后，用3 kg铁锤在0.5 m高处垂直下落，击打兔股骨中段，致粉碎性骨折;再经右颈动脉快速放血(约10 min)使MAP降至35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，并维持90 min。然后，NS组经耳缘静脉回输全部失血及等量生理盐水;MB组回输全部失血及等量生理盐水，并加MB(3 mg/kg)进行复苏，复苏时间约需30 min。CON组动物仅做颈动脉、股动脉插管及全身肝素化，未行击打及放血。
1.4 观察指标 NS组及MB组分别在休克前(T1)、休克末(T2)、复苏末(T3)及复苏后2 h(T4)、4 h(T5)、6 h(T6)和8 h(T7)等时间点测定MAP，并采集血液标本备测血浆BUN、Cr浓度。CON组在各对应时间点同步测定MAP并采血。实验结束后，放血处死动物，开腹取右肾，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，H-E染色，光镜观察形态学变化。
1.5 血浆BUN、Cr水平的测定 经颈动脉于各时间点采血2 ml，4℃低温3 000 r/min离心15 min，取上清液置于-80℃冰箱冷藏。血浆BUN、Cr水平的测定严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.6 统计学处理 所有数据以±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，多组间两两比较采用单因素方差分析，Levene方差齐性检验，方差不齐采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 血流动力学变化 3组动物MAP基础值无明显差异;CON组各时间点MAP较基础值无明显变化。NS组复苏末及复苏后各时间点MAP均未达到基础值水平(P<0.05); 复苏末及复苏后各时间点MAP与CON组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，复苏后2 h、6 h、8 h的MAP与MB组比较差异有统计学意义(P<0.05)。MB组休克末及复苏后2 h MAP与基础值比较差异有统计学意义(P<0.05)，与CON组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 3组兔不同时间点MAP水平的比较( n=6，±s，mmHg)与T1比较：*P<0.05;与CON组比较：#P<0.05;与MB组比较：ΔP<0.05
2.2 血浆BUN、Cr的变化 3组动物血浆BUN、Cr基础值差异无统计学意义(P>0.05)。兔创伤性休克后，NS组及MB组各时间点的血浆BUN、Cr水平比休克前和CON组均有显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但MB组动物复苏后各时间点血浆BUN、Cr水平升高幅度明显低于NS组，差异有统计学意义(P<0.05)。CON组各时间点血浆BUN、Cr水平无明显变化，无统计学意义(P>0.05)。见表2。表2 3组兔不同时间点血浆BUN和Cr水平的比较( n=6，±s)与T1比较：*P<0.05;与CON组比较：#P<0.05;与NS组比较：ΔP<0.05
2.3 肾组织病理学改变 光镜下NS组和MB组肾组织肾小球及肾小管结构大致正常，有轻微的病理改变(图1～4)：NS组可见肾小球毛细血管扩张、充血，少量炎性细胞浸润或正常，MB组可见肾小管上皮细胞正常或轻微水肿。但两组之间无明显差异，较对照组(图5、6)亦无明显改变。
3 讨 论
本实验结果显示，兔创伤性休克复苏后，肾功能受到损害，予以MB复苏后，能明显改善血流动力学，降低血浆BUN、Cr水平，保护肾脏组织。
一氧化氮(NO)是一种不稳定的小分子气体，近年来发现其同时是一种生物活性物质，存在于多种组织和细胞，尤其是血管平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞，均能通过L-精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶( nitric oxide synthase，NOS)作用下合成NO。创伤性休克后机体生成的大量NO主要是TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子激活诱导型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase，iNOS)的结果。iNOS在创伤、休克、感染等病理情况下活性增加，合成大量NO，参与对各脏器功能的损害。NO的大量合成可引起血管扩张、低血压和血管对收缩剂的低反应[2]。在创伤失血性休克时，外周血NO升高可直接作用于外周毛细血管平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶，降低血管平滑肌内Ca2+的浓度，导致血管持续舒张，血压进行性降低[3]。创伤、内毒素、炎症介质和细胞因子刺激血管平滑肌和心肌细胞内的NOS，异常合成和释放大量NO，NO活化鸟苷酸环化酶(GC)，增加细胞内3′，5′-环单磷酸鸟苷(cGMP)，开放钾钙通道，使大量钙离子外流，血管平滑肌和心肌收缩乏力，血管舒张，血压下降，心肌舒缩功能受到抑制，作功能力降低。
MB是一种鸟苷酸环化酶抑制药，可阻断NO的后续作用。MB通过氧化GC活化起关键作用的亚铁血红蛋白和(或)巯醇，选择性强抑制GC，阻断cGMP的升高和钙离子的外流，逆转血管平滑肌和心肌细胞的舒张，增加血管阻力，升高血压，增强心室作功[4]。
国外研究发现[5-6]，感染性休克后，单剂注入中小剂量(1～10 mg·kg-1)的MB，明显改善感染性及失血性休克引起的血流动力学紊乱，改善心肌功能和呼吸功能。王厚清等[7-8]前期的研究发现，MB能改善创伤性休克兔血流动力学，降低血浆NO水平。国内亦有临床报道，MB能改善感染性休克患儿血流动力学方面异常，提高感染性休克治愈率[9]。
NO已经成为了脓毒性休克发病机制中一个重要的致病因素，肾脏NO的产生与患者全身性炎症对近端小管的损伤有关[10]。Heemskerk等[11]发现，对脓毒性休克患者，予以持续静脉注射MB 1 mg/(kg·h)，能减少NO代谢产物和肾小管损伤标记物的尿排泄。其中，NO代谢物较基础值减少了75%～90%，肾小管损伤标记物细胞溶质谷胱甘肽S-转移酶A1-1和P1-1的尿排泄分别较基础值减少了45%和70%。在第1个24 h，肌酐清除率较基础值改善了51%。但是，在MB注射结束后，以上指标均有不同程度的上升。
MB对肾脏的保护作用机制如下：①稳定血流动力学，提高组织灌注压，改善组织氧合，从而保护肾脏功能;②降低血浆NO水平;③清除氧自由基，减少致炎细胞因子的合成与释放。另外，在实验中我们观察到，对创伤性休克兔给予MB复苏后，所有NS组兔均有排尿现象出现，而生理盐水组复苏后则一直无尿，考虑与MB改善血流动力学，提高肾小球滤过率有关。
本研究中虽然NS组和MB组肾脏组织病理学有一些轻微的改变，但较对照组变化不明显，考虑与兔肾脏对缺血的耐受性较强有关。
创伤性休克是许多因素密切联系、互相影响、综合作用的复杂病理生理过程，MB作为一种价廉、易得且有多位点作用的药物，对创伤性休克兔复苏后肾功能的变化有一定影响，但其确切作用机制尚需进一步研究。
参考文献
[1] 吴崇天.创伤性休克[J].中华麻醉学杂志， 2002，22(7):444-446.
[2] Kuhl SJ， Rosen H. Nitric oxide and septic shock. From bench to bedside [J]. West J Med，1998，168(3):176-181.
[3] 王占科，王白岚，陈自力，等.创伤失血性休克患者血清一氧化氮水平变化及其临床意义研究[J].急诊医学，2000，9(6):382-384.
[4] 刘少华，许戟，徐鑫荣.亚甲蓝对感染性休克犬血液动力学和氧合功能的影响[J].江苏医药，2003，29(2):110-112.
[5] Evgenov OV， Sveinbjornsson B， Bjertnaes LJ. Continuously infused methylene blue modulates the early cardiopulmonary response to endotoxin in awake sheep [J]. Acta Anaesthesiol Scand，2001，45(10):1246-1254.
[6] Weingartner R， Oliveira E， Oliveira ES， et al. Blockade of the action of nitric oxide in human septic shock increases systemic vascular resistance and has detrimental effects on pulmonary function after a short infusion of methylene blue [J]. Braz J Med Biol Res，1999，32(12):1505-1513.
[7] 王厚清，李建国，黄祖敏， 等.亚甲蓝对创伤性休克兔血流动力学和脏器损伤的干预作用[J].遵义医学院学报，2005，28(2):126-129.
[8] 李建国，王厚清，黄祖敏， 等.创伤性休克兔血浆一氧化氮的动态变化及亚甲蓝的干预作用[J].贵州医药，2005，29(5):391-393.
[9] 黄明夏，谭道全，方珍琼.亚甲蓝对小儿感染性休克血液动力学和氧代谢影响的临床观察[J].小儿急救医学，2003，10(6):365-367.
[10] Heemskerk S， Pickkers P， Bouw MP， et al. Upregulation of renal inducible nitric oxide synthase during human endotoxemia and sepsis is associated with proximal tubule injury[J]. Clin J Am Soc Nephrol，2006，1(4):853-862.
[11] Heemskerk S， van Haren FM， Foudraine NA， et al. Short-term beneficial effects of methylene blue on kidney damage in septic shock patients [J]. Intensive Care Med，2008，34(2):350-354.