作者：王婷，滕达，陈复兴，陶征中，吕小婷，李佚，张颂，刘军权
【摘要】 目的 探讨吡罗昔康提高γδT细胞杀伤胃癌细胞作用的机制。方法 按常规方法培养γδT细胞;在培养第9天的γδT细胞中加入不同浓度吡罗昔康(分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mmol/L)诱导，24 h后收集培养上清液用于细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素12(IL-12)检测，沉淀细胞用流式细胞术测定穿孔素、粒酶B和NKG2D及用LDH法检测γδT细胞杀伤胃癌细胞活性。结果 吡罗昔康浓度为0.04 mmol/L时诱导的γδT细胞穿孔素和粒酶B分别为78.7 %和71.8%，明显高于对照组(分别为51.4%和60.9%)。吡罗昔康能显著抑制γδT细胞NKG2D的表达，并随着药物浓度的增加作用越明显。γδT细胞经吡罗昔康诱导24 h后，培养上清液中IFN-γ和IL-12浓度与对照组比较没有明显变化;但能抑制TNF-α的分泌，并且随着药物浓度的增加抑制作用越明显。γδT细胞杀伤胃癌细胞BCG-823的活性在0.04 mmol/L时最高(75%)，明显高于对照组(58%)。结论 经吡罗昔康诱导后γδT细胞杀伤BCG-823活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达较高浓度的穿孔素和粒酶B有关。
【关键词】 γδT细胞;吡罗昔康;穿孔素;粒酶B;NKG2D;γ-干扰素;α-肿瘤坏死因子;白细胞介素12;胃癌
Abstract: Objective To explore the effect of piroxicam in enhancing the cytotoxicity of human γδT cells to gastric cancer cells. Methods γδT cells were routinely cultured and collected on the 9th day， followed by induction with piroxicam at different concentrations (0.01 mmol· L-1， 0.02 mmol· L-1， 0.04 mmol· L-1， 0.08 mmol· L-1 and 0.16 mmol· L-1， respectively). 24 h later， the supernatants were collected for the detection of IFN-γ， TNF-α and IL-12， and the sediments were detected for the amount of perforin， granzyme B and NKG2D by flow cytometry (FCM) as well as the cytotoxicity of γδT cells to gastric cancer cells by LDH. Results The expression levels of perforin and granzyme B (78.7 % and 71.8%， respectively) of γδT cells which were induced by piroxicam at the concentration of 0.04 mmol· L-1 was significantly higher than those of the control group (51.4% and 60.9%， respectively). The expression of NKG2D was remarkably inhibited by piroxicam in a positive correlation with the concentrations of drugs. The amounts of IFN-γ and IL-12 secreted by γδT cells of piroxicam induction for 24 h had no significant difference in contrast to the control group， however， the secretion of TNF-α was inhibited in a dose dependent manner. The cytotoxicity of γδT cells to the gastric cancer cell line BCG-823 (75%) was significantly higher than the control group (58%). Conclusion The cytotoxicity of piroxicam-induced γδT cells to gastric cancer cell line BCG-823 was markedly enhanced， the mechanism of which might be related to the higher levels of perforin and granzyme B expressed in γδT cells.
Key words： γδT cells; piroxicam; perforin; granzyme B; NKG2D; IFN-γ; TNF-α; IL-12; gastric cancer
胃癌是消化道最常见恶性肿瘤之一，在我国的发病率和死亡率居各种恶性肿瘤首位，超过2/3确诊胃癌的患者不可手术切除，即使可行手术切除其复发率也很高[1]。因此，胃癌的预防和早期治疗尤为重要。流行病学调查发现，吡罗昔康和其他非甾体类抗炎药一样，长期服用能减少和预防消化道肿瘤的发生[2]，体外试验证明，吡罗昔康能提高人γδT细胞杀伤胃癌细胞的活性[3]。γδT细胞是广泛分布于消化系统、呼吸系统等黏膜和上皮组织内的固有免疫T细胞，具有抗原提呈、杀伤肿瘤和免疫调节作用[4-5]。为此，我们试用不同浓度的吡罗昔康在体外诱导人γδT细胞，观察吡罗昔康对人γδT细胞的穿孔素(perforin)、粒酶B(Gran B)、NKG2D和分泌γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素12(IL-12)3种细胞因子的影响，以探讨吡罗昔康提高γδT细胞杀伤肿瘤细胞作用的机制。
1 材料和方法
1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC-7901、BCG-823(上海细胞生物研究所)，胰蛋白酶、RPMI 1640(Gibco公司)，人AB血清(徐州市血站)，胎牛血清和淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)，戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate，IPP)，吡罗昔康(Sigma公司)，白细胞介素2(IL-2，厦门特宝生物公司)，IFN-γ、TNF-α和IL-12酶免检测试剂盒(Bemder medsysterms公司)，FITC标记的抗人TCR-γδ和PE标记的穿孔素、粒酶B和NKG2D抗体(杭州联科生物，Immunotech， France)，乳酸脱氢酶试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社)。FACS Caliber流式细胞仪(BD公司)，流式细胞仪分析软件为CellQuest，每个标本分析细胞数≥1×104个。
1.2 方法
1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 按文献[6]进行。取健康献血者末梢抗凝血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，PBMC经生理盐水洗涤3次后，用含10%小牛血清、5%人AB血清、2×105 U/L IL-2和3 μg/L IPP的RPMI 1640培养液调整细胞数为5×108个/L，置75 cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况添加培养液。收集培养9天的细胞进行细胞表面标志检测和其他实验。
1.2.2 吡罗昔康对γδT细胞的诱导 收集培养第9天的γδT细胞，用无血清培养基洗涤3次后配成2×109个/L细胞悬液，加入6孔细胞培养板，5 ml/孔。然后分别加入不同浓度的吡罗昔康(终浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mmol/L)，37℃孵育24 h，收集细胞和培养上清液进行相关指标的检测。
1.2.3 γδT细胞杀伤活性检测 用本室建立的乳酸脱氢酶释放法[7]测定γδT细胞杀伤活性。将上述经吡罗昔康诱导后的γδT细胞(效应细胞)及胃腺癌SGC-7901、BCG-823细胞(靶细胞)分别配成2×109个/L和2×108个/L细胞悬液。将效应细胞和靶细胞数按10∶1比例混合，以500 r/min离心5 min，置37℃、5%CO2孵箱中孵育6 h后，轻轻混匀细胞，再以1 500 r/ min离心10 min，收集上清液在全自动生化分析仪340 nm波长下测定光密度(D)(实验组)。每测试样本均设未加药物诱导的对照组，同时检测单靶细胞的自然释放值和单效应细胞的自然释放值。
γδT细胞杀伤活性(%)=
(D实验组-D效应细胞自然释放组)(D靶细胞最大释放组-D靶细胞自然释放组)×100%
1.2.4 吡罗昔康对γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D及细胞因子的影响 取上述经吡罗昔康诱导后的γδT细胞培养上清液，酶免检测试剂盒检测IFN-γ、TNF-α、IL-12;沉淀细胞用流式细胞术测定其穿孔素、粒酶B和NKG2D。每测试样本均设未加药物诱导的对照组。细胞因子检测方法严格按试剂操作说明书进行。每测试样本重复5次。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，数据以±s表示。组间比较采用Dunnett法单向方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 γδT细胞培养和鉴定 PBMC经9天培养后可见大的集落，单个细胞可见细胞呈条梭状。收集培养前后细胞用FITC标记的抗人TCR-γδ荧光标记后经流式细胞术检测并分析结果。培养前γδT细胞数为5.12%;培养9天时γδT细胞数为91.27%。
2.2 不同浓度的吡罗昔康对γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D的影响 γδT细胞经不同浓度吡罗昔康诱导后对其穿孔素、粒酶B有一定的影响，表现为先增加后抑制的趋势。吡罗昔康浓度在0.04 mmol/L时γδT细胞穿孔素和粒酶B表达量最高，分别为78.7 %和71.8%，明显高于对照组(分别为51.4%和60.9%)。各浓度的吡罗昔康均能显著抑制γδT细胞NKG2D的表达，并随着药物浓度的增加抑制作用越明显。结果见表1。表1 吡罗昔康对γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D影响(n=10，±s，%)
2.3 不同浓度的吡罗昔康对γδT细胞分泌3种细胞因子的影响 γδT细胞经不同浓度吡罗昔康诱导24 h后，培养上清液中IFN-γ和IL-12浓度与对照组比较没有明显变化;但其分泌的TNF-α明显低于对照组，并随着药物浓度的增加抑制作用越明显。结果见表2。表2 吡罗昔康对γδT细胞分泌3种细胞因子影响(n=10，±s，μg/L)
2.4 经吡罗昔康诱导后γδT细胞杀伤活性结果 γδT细胞经不同浓度的吡罗昔康诱导24 h后杀伤SGC-7901和BCG-823细胞作用有明显差异：各浓度组诱导的γδT细胞对SGC-7901杀伤活性表现为逐渐降低趋势;而其对BCG-823细胞的杀伤活性，随着诱导药物浓度的提高，γδT细胞对BCG-823肿瘤细胞的杀伤活性表现为先增加后抑制的趋势，浓度在0.04mmol/L作用最强(76%)，与对照组(58%)比较有显著性差异(P<0.05)。结果见表3。表3 吡罗昔康对γδT细胞杀伤胃癌细胞活性的影响(n=10，±s，%)
3 讨 论
西方流行病学调查发现，使用非甾体类抗炎药治疗的类风湿关节炎患者的结肠癌发病率下降40%～60%，长期服用非甾体类抗炎药还能减少和预防食管癌和胃癌等肿瘤的发生[8-9]。吡罗昔康也是一种非甾体抗炎药，因其具有消炎、解热、镇痛及用药剂量小、作用持续时间长、每日只口服1次、短期服用副作用小等优点而被临床选用。为探讨其对肿瘤的影响，许多学者在体外应用吡罗昔康对消化系统肿瘤细胞进行了一系列研究，并证明其对肿瘤具有明显的抑制作用[10-11]。
自20世纪80年代发现T细胞具有γδ受体以来，有关γδT细胞在免疫调节、肿瘤免疫监视和特异性初次免疫应答中所起的关键作用已不断地被认识[1，4]。γδT细胞是广泛分布于黏膜上皮组织内的固有免疫T细胞，它的抗肿瘤效应除了有与αβT细胞类似的一些功能特征外，γδT细胞识别多肽抗原时无MHC限制，而且还能识别一些非多肽抗原。许多研究认为，γδT细胞的抗肿瘤功能可能与细胞表达的穿孔素、粒酶B和NKG2D受体及γδT细胞分泌的细胞因子有关。
穿孔素存在于细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和γδT细胞胞质的细胞毒颗粒中，当这些细胞与靶细胞接触后可释放穿孔素，在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏[12]。粒酶B[13]是杀伤性T细胞(CTL)和NK细胞颗粒(granule)中最重要的丝氨酸蛋白酶，通过caspases依赖途径、直接入核途径及不依赖caspases的胞质途径杀伤靶细胞。NKG2D主要作用是将受到感染或损伤的细胞通过中间受体将信号传导至机体的免疫系统，诱导机体产生免疫应答，NKG2D识别和结合感染细胞及肿瘤细胞表面表达的配体，使DAP10 的YxxM 基序磷酸化，继而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的P85亚基，下游Akt磷酸化、启动ERK1/2MAP激酶旁路，动员Ca2+内流，传递活化信号，激活或者协同激活NK、γδT细胞等，继而杀伤靶细胞，在肿瘤细胞的预防方面具有重要的作用[14]。IL-12是由抗原递呈细胞产生的、具有多种免疫调节作用的细胞因子，其主要活性是诱导NK细胞和T细胞产生IFN-γ，增加NK细胞的杀伤能力以及细胞毒T细胞的特异性细胞毒活性[15]。与Nishiyori等[16]报道的吡罗昔康对T细胞有调节作用相类似，本实验结果发现，人外周血中培养的γδT细胞经吡罗昔康诱导后穿孔素、粒酶B明显高于对照组，尤其是吡罗昔康浓度为0.04 mmol/L时最显著。因此，在体外经吡罗昔康诱导后γδT细胞杀伤BCG-823活性明显增高的原因可能与较高含量的穿孔素、粒酶B有关。经吡罗昔康诱导后γδT细胞分泌IFN-γ、IL-12无明显变化，对TNF-α反而有抑制作用，而这些细胞因子在体内能调节和诱导T细胞活化，增强机体的免疫监视和免疫防御功能，说明吡罗昔康仅能适当提高γδT细胞的杀瘤功能，对免疫细胞分泌的细胞因子的作用有一定的局限性。
我们在前期实验发现，吡罗昔康可提高γδT细胞的增殖率，增强γδT细胞杀伤肿瘤细胞活性，在相同浓度的γδT细胞作用下，吡罗昔康诱导的γδT细胞导致肿瘤细胞的凋亡率明显高于单纯γδT细胞导致肿瘤细胞的凋亡率[3]。结合前期的研究结果进行了进一步试验，发现吡罗昔康还能提高γδT细胞的穿孔素、粒酶B含量。但γδT细胞杀伤SGC-7901与BCG-823结果有明显的差异，其原因是否为2种肿瘤细胞表面表达的NKG2D配体(MICA)等识别信号有差异有待进一步探讨，因为MICA mRNA表达强度与NK细胞杀伤敏感性高度相关[17]。
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