作者：张林，程晓刚，练栩辉，李鑫，刘林娜，赵柏程，任飞，李晗郡，刘平
【摘要】 目的 克隆小鼠IL-33基因(mIL-33)cDNA构建其真核表达质粒，并转染EL-4细胞检测其表达。方法 提取小鼠脑与肺组织总RNA，经逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因cDNA，酶切后插入pcDNA-3.1构建其真核表达载体pcDNA-mIL-33，重组质粒转染EL-4细胞，RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。结果 pcDNA-mIL-33中插入的DNA序列测定结果与mIL-33 cDNA序列一致，重组质粒转染EL-4细胞后检测到相应基因表达。结论 成功克隆小鼠IL-33基因cDNA，并构建其真核表达质粒。
【关键词】 IL-33；基因克隆；真核表达
Abstract: Objective To clone and construct the eukaryotic expression plasmids containing mouse IL-33 cDNA and investigate their expression. Methods Total RNA was extracted from mouse lung and brain tissues to amplify mouse interleukin-33 (mIL-33) cDNA by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The eukaryotic expression plasmids pcDNA-mIL-33 was constructed with the insertion of enzyme-digested pcDNA-3.1(+) vector to construct eukaryotic expression vector pcDNA-mIL-33. The recombinant plasmids were transfected into EL-4 cells and the expression of target gene was detected by RT-PCR and ELISA. Results The inserted DNA sequence in pcDNA-mIL-33 was identical to the mIL-33 cDNA， which was verified correctly by sequencing. The corresponding gene expression was detected in the recombinant plasmid-transfected EL-4 cells.Conclusion The mouse IL-33 cDNA was successfully cloned and its eukaryotic expression plasmids were constructed.
Key words: IL-33; gene cloning; eukaryotic expression
白细胞介素33（IL-33）是近几年发现的细胞因子，为IL-1类细胞因子超家族成员［1］，已发现其在小鼠及人各组织内皮与上皮细胞中均有广泛表达。其相应受体为由IL-1受体1（interleukin-1 receptor-like 1，IL1RL1）和IL-1受体辅助蛋白（IL-1R accessory protein，IL-1RAcP）2个亚基组成的异源二聚体，其中IL1RL1又称蛋白ST2［2］，上述两亚基均为IL-1受体超家族成员。研究表明IL-33和其配体结合后可促进肥大细胞与Th3细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子并促进炎症反应［3-4］，在过敏性哮喘、过敏性休克、肺纤维化、风湿性关节炎等自身免疫性疾病及脓毒血症、败血性休克、某些恶性肿瘤与心肌炎等发生发展中起重要作用［5-6］。本研究旨在克隆小鼠IL-33基因的cDNA，构建其真核表达质粒pcDNA-mIL-33并实现在EL-4细胞中表达，为研究IL-33蛋白的生物学功能并为实现其原核表达奠定基础。
1 材料和方法
1.1 动物、质粒和菌株
BALB/c小鼠来自本校科研中心动物室，真核表达质粒pcDNA3.1(+)（5.4 kb) 、大肠杆菌E.coli DH5α菌株、小鼠淋巴瘤细胞株EL-4为本校免疫学教研室保存。
1.2 主要试剂和器材
载体连接试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA凝胶回收试剂盒、PCR试剂购自TaKaRa公司，T4DNA连接酶为Promega公司产品，质粒抽提试剂盒购自Omega公司，Trizol为Invitrogen公司产品，RevertAidTM cDNA第一链合成试剂盒为Fermentas公司产品，KeyGenTrans Ⅲ质粒转染试剂、细胞裂解液及蛋白酶抑制剂购自凯基生物发展有限公司，Mouse IL-33 Quantikine ELISA Kit购自R&D 公司。细胞生长液RPMI 1640培养基为GIBCO BRL公司产品，加10%小牛血清，1×105 U/L青霉素， 1×105 μg/L链霉素。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，56℃灭活30 min，-20℃保存待用。其他试剂为进口或国产分析纯。
1.3 引物设计
据文献报道基因序列［1］设计引物。mIL-33上游引物(P1)：自起始密码ATG 起始， 5′端含Hind Ⅲ酶切位点，5′-CCCAAGCTTATGAGACCTAGAATGAAGTAT-3′。mIL-33下游引物(P2)：自终止密码TAG开始，5′端含Xba Ⅰ酶切位点，5′-GCTCTAGATTAGATTTTCGAGAGCTTAAAC-3′。上述引物由上海博亚生物技术公司合成。
1.4 pcDNA-mIL-33质粒的构建
分离小鼠脑与肺组织，常规提取总RNA，按Fermentas公司提供的cDNA第一链合成说明进行反应获得cDNA，随即进行聚合酶链反应（PCR）获得mIL-33基因编码序列，反应条件：94℃4 min，进入循环，94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。取扩增产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后经Hind Ⅲ与Xba Ⅰ酶切，插入上述酶酶切线性化的pcDNA-3.1(+)载体， 连接后转化DH5α感受态菌，过夜培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒DNA 进行酶切鉴定，命名为pcDNA-mIL-33。上海鼎安生物科技有限公司进行插入DNA序列测定。
1.5 重组质粒的细胞转染与表达
对数生长期EL-4细胞培养于含10%灭活小牛血清、1×105 U/L青霉素、1×105 μg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2的培养箱中培养，将3×105个细胞接种于6孔板培养24 h后，采用KeyGenTrans Ⅲ质粒转染试剂按试剂说明转染pcDNA-mIL-33与空载体，并设空白对照，10 h后弃去转染液，换新鲜培养基继续培养，转染后24 h分别收集实验孔及空载体对照孔、空白对照孔的细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测细胞mIL-33基因表达；于转染后不同时间用冰冷细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解产物，ELISA法检测培养细胞mIL-33表达水平，检测方法按试剂说明进行。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增小鼠IL-33基因
分离小鼠脑与肺组织总RNA，进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下可见3条清晰条带，分别为28s RNA、18s RNA和5s RNA（图1A），28s RNA与18s RNA无弥散现象，说明RNA未被降解。总RNA经逆转录为cDNA后进行PCR反应，将产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见一亮带，大小约800 bp，与mIL-33基因cDNA片断预期大小相符（图1B）。
2.2 pcDNA-mIL-33真核表达质粒的构建
Hind Ⅲ与XbaⅠ双酶切后的小鼠脑组织IL-33 cDNA的PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳回收，与上述酶酶切后的pcDNA3.1进行定向连接，连接后转化DH5α感受态菌。抽提质粒，行Hind Ⅲ与XbaⅠ双酶切鉴定，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符（图2）。上海鼎安生物科技有限公司DNA测序结果与mIL-33 cDNA序列一致。
2.3 重组质粒在EL-4细胞中的表达
分别收集空白对照、pcDNA-mIL-33与空载体转染的EL-4细胞，逆转录获得cDNA模板进行PCR扩增。结果表明，从重组质粒转染的EL-4细胞中可扩增出mIL-33基因，而空质粒转染和未转染细胞中未扩增出目的条带（图3）；ELISA法证实pcDNA-mIL-33转染细胞24 h后的细胞裂解产物可检测到mIL-33表达为（36.64±7.69）ng/L，48 h可达（102.43±10.58）ng/L，而空载体转染细胞和未转染细胞未检测到其表达。
3 讨论
IL-33为新近发现的IL-1类细胞因子超家族成员［1］，在小鼠与人体胃肠道、肺组织上皮细胞与中枢神经系统星形胶质细胞［7］中均有广泛表达，研究证实IL-33主要通过激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞与嗜碱性粒细胞，并诱导产生IL-5、IL-13等细胞因子参与炎症反应［3-4］，并在许多自身免疫性疾病及脓毒血症、败血性、某些恶性肿瘤与心肌炎等疾病的发生发展中起较重要的作用［5-6］。
在本实验中我们成功提取小鼠脑与肺组织总RNA，凝胶电泳实验表明提取的RNA质量可靠，基本没有降解，可用于后续实验，并采用RT-PCR的方法成功获取mIL-33 cDNA序列。为节约实验时间与成本，我们根据载体本身的序列特点，在合成PCR引物时在引物的5′端引入相应的限制性内切酶酶切位点，这样合成的cDNA只需用适宜的限制性内切酶消化后即可产生有效的定向连接末端以便于与酶切后的载体连接，这样实现了直接将cDNA酶切片段与目标载体连接，省去T/A克隆步骤，使实验过程更加简便快速。所克隆的mIL-33 cDNA序列经测序表明与文献报道一致，构建的pcDNA3.1-mIL-33质粒阅读框架正确，构建的质粒转染EL-4细胞后在mRNA与蛋白水平均成功检测到mIL-33基因的表达。本实验为进一步研究成熟的IL-33生物学功能，并实现原核构建与表达具有生物学活性的重组IL-33蛋白奠定了基础。
参考文献
［1］Schmitz J， Owyang A， Oldham E， et al. IL-33， an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines ［J］.Immunity，2005，23(5)：479-490.
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［4］Smithgall MD， Comeau MR， Yoon BR， et al. IL-33 amplifies both Th1- and Th3-type responses through its activity on human basophils， allergen-reactive Th3 cells， iNKT and NK cells ［J］. Int Immunol，2008，20(8)：1019-1030.
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