胃动素受体在大鼠各脑区的分布

　　　　 作者：刘梅，董蕾，段钟平，陈煜，刘旭华，郑素军

【摘要】 目的 检测胃动素受体在大鼠中枢各核团的分布，探索胃动素的中枢作用机制。方法 本实验以成年SD大鼠为研究对象，采用免疫组织化学方法检测大鼠脑胃动素受体分布。结果 大鼠中枢胃动素受体主要分布于神经细胞的胞膜上，而胞质及核膜未见明显阳性染色;胃动素受体在大鼠摄食、记忆相关脑区的分布为：海马CA1(4.02±1.27)、CA2(3.43±2.21)、CA3(6.10±4.03)、CA4(3.25±1.32)，下丘脑腹内侧核(Vmh，2.52±1.37)、下丘脑外侧区(Lh， 4.50±2.61)，杏仁内侧核(Me， 5.14±2.27)、杏仁基底内侧核(Bm， 2.14±1.93)、杏仁基底外侧核前部(Bla， 3.98±1.86)、杏仁基底外侧核后部(Blp， 4.01±2.45)、杏仁中央核(Ce， 1.22±1.33)、杏仁外侧核(La， 2.43±1.78)，海马CA3区为胃动素受体分布最多的部位。结论 中枢胃动素受体是一种细胞膜受体;胃动素是一种神经调节递质，其受体广泛分布于脑内多个核团;胃动素作用于中枢的胃动素受体，在记忆、情绪、食欲、进食等方面可能起着广泛的调节作用。

【关键词】 胃动素受体;大鼠;中枢分布

　　ABSTRACT: Objective To detect the distribution of motilin receptors in the rat brain nuclei and explore the potential mechanism of the central role of motilins.Methods Immunohistochemistry was used to detect the distribution of motilin receptors in the brain of adult SpragueDawley (SD) rats.Results Motilin receptors were predominately distributed on the nerve cell membrane of the rat brain; in contrast， the cytoplasm and nuclear membrane had no obvious positive staining. The distribution of motilin receptors in feeding and memoryrelated brain areas in rats were as follows: hippocampal CA1 (4.02±1.27)， CA2 (3.43±2.21)， CA3 (6.10±4.03)， CA4 (3.25±1.32); rentromedial hypothalamis ventromedial hypothalamic nucleus (Vmh， 2.52±1.37)， lateral hypothalamic area (Lh， 4.50±2.61); amygdala medial amygdaloid nucleus (Me，5.14±2.27)， basomedial nucleus of the amygdale (Bm， 2.14±1.93)， anterior pision of the basolateral nucleus of the amygdale (Bla， 3.98±1.86)， posterior pision of the basolateral nucleus of the amygdale (Blp， 4.01±2.45)， central amygdaloid nucleus (Ce， 1.22±1.33)， and lateral amygdaloid nucleus (La， 2.43±1.78). We found that hippocampal CA3 area had the densest motilin receptors. Conclusion Central motilin receptor is a type of cell membrane receptor. Motilin is a neurotransmitter and its receptors are widely distributed in various brain nuclei. Motilin may play a potential role in regulating memory， mood， appetite and eating.

　　KEY WORDS: motilin receptor; rat; central distribution

　　胃动素(motilin， MTL)是一种脑肠肽，广泛分布于外周及中枢神经系统。在大多数哺乳动物，产MTL的细胞分布在小肠上段，特别是在十二指肠近端空肠的黏膜隐窝中，此外，还存在于垂体、下丘脑、延髓、小脑等组织中[1]。MTL调节胃肠消化间期移行性复合肌电波(migrating motor complex， MMC)Ⅲ相收缩，然而MTL作用的确切机制尚不清楚，主要是因为在体和离体的研究结果不一致。离体研究显示MTL直接作用于胃肠道平滑肌细胞上的胃动素受体(motilin receptor， MTLR)，而在体研究却显示MTLR很可能存在于神经系统中[12]。因此，研究MTLR的分布对全面了解MTL的作用机制是必需的。MTLR在外周的分布已经有报道，而其在中枢神经系统的分布研究很少。本研究采用免疫组织化学的方法，检测大鼠中枢各脑区的MTLR分布。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 抗体：兔抗人MTLR抗体(美国ADI公司);ABC试剂盒(武汉博士德)。

　　1.2 实验动物 成年健康SD大鼠20只，雌雄不拘，体重220～250g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。用颗粒型大鼠饲料饲喂，饮用自来水，动物房温度维持在18～26℃，光暗周期为12h∶12h。取脑前在上述条件下喂养3d。

　　1.3 组织制备 大鼠给予100g/L水合氯醛(3mL/kg体重)腹腔注射麻醉，打开胸腔，经左心室穿刺至主动脉，用37℃生理盐水500mL，快冲血管床，用40g/L多聚甲醛PB缓冲液(pH 7.4，4℃)500mL经升主动脉缓慢灌注，时间约为2h，开颅取脑，切成厚4mm小块，生理盐水冲净，40g/L多聚甲醛后固定8h，自来水冲洗24h，200～300g/L蔗糖溶液梯度脱水，组织包埋剂包埋，恒冷冰冻切片机连续冠状切片，脑片厚约20μm，粘贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片。将切片分3套，第1套做MTLR免疫组织化学染色，第2套做HE染色(与第1套切片相邻，用于组织学定位)，第3套做免疫组织化学阴性对照实验。

　　1.4 免疫组织化学染色方法 免疫组织化学染色采用ABC法。冰冻切片PBS洗2min×3次，3mL/L h3O2室温10min，PBS漂洗2min×3次，加15mL/L封闭血清，在湿盒中室温孵育30min，弃去不洗，加入MTLR抗体(1∶500)4℃孵育24h;室温放置2h后，PBS漂洗2min×3次，加生物素标记的抗兔IgG室温2h，PBS漂洗2min×3次，加ABC复合物室温2h，DAB显色剂显色10min，PBS中止反应，经梯度酒精脱水及二甲苯透明后，中性树胶封片保存。

　　阴性对照组用正常血清代替第1抗体或用PBS代替第2抗体，其余步骤不变。

　　1.5 实验结果观察 MTLR阳性细胞判定：阳性细胞为胞核和胞质不着色，胞膜着黄色或棕黄色的细胞。每张染色片选取5个高倍视野，采用二级计分法，首先按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;然后按阳性细胞率评分：细胞无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将二者相加得综合免疫组化评分：0定为-，1～4分为+，5～7分为。

　　1.6 统计学处理 使用SPSS11.5软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)及中位数(M)表示，计量资料在满足参数检验条件时采用单因素方差分析，否则采用秩和检验进行组间比较，P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTLR阳性细胞的形态及分布特点 阳性细胞的胞膜为棕色沉着，细胞核无棕色颗粒沉着。多个脑区神经元的胞体和树突均可观察到MTLR阳性反应物质(motilin receptorimmunoreactiveties， MRIR)。阴性对照片结果阴性(图1)。

　　在大脑皮层区，各层细胞都有MTLR阳性反应细胞。在分子层、外颗粒层、多形细胞层阳性反应较弱，染色呈淡黄色，细胞轮廓不清晰，大致呈圆形或者椭圆形，体积较小，阳性细胞平均直径约为5μm。在内颗粒层，阳性反应较强，阳性细胞呈环状，细胞突起无染色，轮廓清晰，胞核不着色，胞膜有棕色颗粒沉着，阳性细胞平均直径为8μm。在节细胞层，阳性反应强，阳性细胞呈三角形或锥形，细胞突起染色明显，均呈棕色，胞核亦不着色，阳性细胞平均直径为16μm(图2)。

　　在海马CA1、CA2、CA3和CA4区，颗粒层细胞均呈较强的阳性反应，细胞呈圆形，胞膜有黄色颗粒沉着，胞体平均直径为5μm。分子层未着色(图3A)。锥体细胞层可见3～4层阳性染色强的细胞，细胞呈圆形或椭圆形，胞膜着深棕色，突起粗短并且着色明显，胞质淡染，阳性细胞平均直径为20μm(图3B)。

　　下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area， Lh)、下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamic nucleus， Vmh)、背侧核(dorsal hypothalamic nucleus， Do)、室周核(periventrioular hypothalamic nucleus， Pe)和弓状核(arcuate hypothalamic nucleus， Ar)都有MTLR阳性细胞分布，阳性反应较强，阳性细胞染色较深(图4)。

　　杏仁核区存在有较多量的MTLR阳性细胞，阳性细胞的胞膜为棕色颗粒沉着，胞质及胞核无棕色颗粒沉着。杏仁内侧核(medial amygdaloid nucleus， Me)呈强阳性反应，细胞数目多，胞膜呈深棕色，胞核及胞质不着色，胞体呈圆形或椭圆形，多数细胞有短粗突起;杏仁基底内侧核(basomedial nucleus of the amygdale， Bm)阳性细胞数很少，胞体较小，染色呈淡黄色;杏仁基底外侧核前部(anterior pision of the basolateral nucleus of the amygdale， Bla)与后部(posterior pision of the basolateral nucleus of the amygdale， Blp)都有较多阳性细胞，胞体较大，染色呈淡棕色，胞体有短粗突起;杏仁中央核(central amygdaloid nucleus， Ce)也有少数淡染的阳性细胞;杏仁外侧核(lateral amygdaloid nucleus， La)阳性细胞数目较少，染色淡，分布稀疏。

　　此外，丘脑后核(posterior thalamic nucleus， Po)、丘脑腹后内侧核(ventral posteromedial thalamic nucleus， Vpm)、丘脑腹后外侧核(ventral posterolateral thalamic nucleus， Vpl)、丘脑中央旁核(paracentral thalamic nucleus， Pc)、丘脑内侧背核(mediodorsal thalamic nucleus， Mdl)、丘脑中央内侧核(centromedial thalamic nucleus， Cm)、丘脑棱形核(rhomboid thalamic nucleus， Rh)和丘脑连接核(reuniens thalamic nucleus， Re)都可见阳性细胞(图5)。

　　A：丘脑中央内侧核、丘脑棱形核、丘脑连接核胃动素受体(×100);B：丘脑后核、丘脑腹后内侧核、丘脑腹后外侧核、丘脑中央旁核、丘脑内侧背核胃动素受体(×100)。

　　小脑蒲肯野氏细胞(Purkinjes cell)呈强阳性反应，胞体呈梨形，胞膜着深棕色，直径约25μm，突起无明显着色，颗粒细胞着色较浅，胞体平均直径为5μm(图6)。此外，在前庭神经上核、外侧核、中缝核、小细胞网状核、旁巨细胞网状核和面神经核等处皆可见到阳性细胞(图7)。

　　2.2 胃动素受体在摄食、学习记忆相关脑区的表达

　　大鼠摄食、学习记忆相关各脑区阳性细胞表达见表1。海马CA1、CA2、CA3和CA4区MTLR阳性细胞评分，以CA3区为最高，阳性反应也最强，由于数据不符合正态性及方差齐性的要求，采用KruskalWallis秩和检验，H=6.241，P=0.014，海马4个区MTLR阳性细胞表达差别有统计学意义。下丘脑阳性细胞评分以下丘脑外侧区居高，由于数据不符合正态性及方差齐性的要求，采用MannWhitney秩和检验进行分析，U=5.568，P=0.026，下丘脑内、外侧区MTLR阳性细胞表达差别有统计学意义。杏仁核各亚核团阳性细胞评分(中位数)以杏仁内侧核最高，杏仁中央核最低，由于数据不符合正态性及方差齐性的要求，采用KruskalWallis秩和检验，H=　9.276，P=0.010，杏仁核各区MTLR阳性细胞表达差别有统计学意义。表1 大鼠各脑区胃动素受体的表达情况

　　3 讨 论

　　文献报道有关MTLR中枢分布的研究较少。1997年比利时学者DEPOORTERE[3]利用125I标记的猪MTL使之与兔脑组织切片上的MTLR结合，采用放射自显影的方法，测定了兔前脑冠状切面上碘标记MTL的结合量，发现在海马CA1区、丘脑、下丘脑和杏仁核存在MTLR。本实验结果显示，大鼠MTLR在中枢神经系统内广泛存在，主要分布于大脑皮层、海马、下丘脑、丘脑、杏仁核、小脑皮质浦肯野细胞及脑干，与前述研究结果相似。MTLR在脑内多个核团的存在，提示MTL作用的广泛性。虽然目前没有证据证明MTL参与了中枢功能的调控，但已有资料显示中枢给予MTL可以抑制排尿反射而刺激进食行为[4];亦有研究提示MTL可能与下丘脑生长激素分泌的调控有关[5]。MTL及其受体在中枢的广泛存在，提示MTL可能是一种中枢神经调质。

　　本实验免疫组织化学研究显示，MTLR阳性细胞的胞核和胞质不着色，胞膜着黄色或棕黄色，提示MTLR是一种细胞膜受体，在细胞核或者胞质中不存在或者微量。与以往组织匀浆放射配基法的研究结果一致。MILLER等[6]实验表明，在胃组织中胃窦的MTLR的浓度最高，这些受体可以在胃窦平滑肌膜上检测出，但主要存在于胃窦壁的神经结构中，并且人平滑肌膜与神经源性膜上的MTLR对于不同的MTLR激动剂与拮抗剂表现出不同的亲和力，此项研究提示平滑肌膜上的MTLR(即M型)与神经膜上的MTLR(即N型)是存在于体内的两种不同的MTLR亚型。外周的N型MTLR与本实验中测定的中枢神经系统的受体是否为同一类型，仍需要药物动力学实验的进一步证明。

　　海马结构由海马本部、齿状回、下托、束状回和灰被组成。依据海马本部的细胞构筑可再将其划分为4个亚区，分别命名为CA1、CA2、CA3及CA4区。本实验研究结果显示，海马各区均有MTLR阳性细胞存在，而在CA3区最多。海马不仅与认知功能如学习、情感、记忆有关，也是调节内脏活动的重要中枢，它与下丘脑、杏仁核、延髓髓质有着极其复杂的相互联系，在调节哺乳动物的进食行为与饱感中发挥着重要作用[7]。神经电生理研究显示，海马与摄食行为、饱感关系密切[8]。大量MTLR在海马CA3区的存在，推测这些MTLR可能与动物的进食行为有关。

　　下丘脑位于大脑腹面、丘脑的下方，是调节内脏活动和内分泌活动的较高级神经中枢所在。下丘脑调节人体的体温、摄食、水平衡、血压、内分泌和情绪反应等重要生理过程。如损毁双侧下丘脑的外侧区，动物即拒食拒饮而死亡;损毁双侧腹内侧区，则摄食量大增引起肥胖。许多研究证明，大鼠脑内存在着MTL免疫反应阳性神经元，下丘脑与胃动力密切相关[9]。在下丘脑内侧基底部和正中隆起具有中等浓度的MTL分布。本研究结果也显示，下丘脑外侧区、下丘脑的腹内侧核、背侧核、室周核和弓状核都有MTLR阳性细胞分布，以外侧区为多。提示在摄食行为的调节中，下丘脑外侧区发挥着重要作用。

　　杏仁核位于颞叶前内侧部，其后为海马结构的腹侧部，是由多个解剖和功能不同的亚核团组成的复合结构。主要分为皮质内侧核群与基底外侧核群两大核群和前杏仁区、皮质杏仁移行区两大过渡区。研究表明，杏仁核在进食行为的调节中有着重要的作用。有研究证实，杏仁核的损伤可导致正常摄食的明显变化，杏仁中央核的损伤引起厌食和体重下降，而基底外侧核的受损则伴有食欲亢进和体重的增加[10]。本实验结果显示，杏仁核各亚核团都有MTLR分布，杏仁内侧核是MTLR分布最多的部位;杏仁基底外侧核也有较多受体分布，并且后部多于前部;分布较少的核团是杏仁基底内侧核、杏仁中央核、杏仁基底外侧核。这种分布特点并不能解释前述的杏仁核损伤所引起的摄食行为和体重的变化，这可能是因为摄食行为和体重的调节是通过多种递质和受体的相互作用来实现的，而不仅仅与MTLR的数量相关。

　　综上所述，MTLR是一种细胞膜受体，在中枢各脑区广泛存在，其主要分布部位有：大脑皮层、海马、下丘脑、丘脑、杏仁核、小脑皮质浦肯野细胞及脑干。MTL可能作为一种神经调节递质广泛作用于中枢各脑区。在摄食、学习记忆相关脑区，MTLR分布量较多，主要为海马CA3区、杏仁基底外侧核以及下丘脑外侧区。海马CA3区和下丘脑外侧区的MTLR分布与其对摄食的生理调节功能相一致，而杏仁基底外侧核MTLR表达强于杏仁中央核，与其摄食控制功能不一致，具体机制仍有待进一步研究。

参考文献

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