宁夏回族高脂血症患者CYP2C9*3、MSA2756G基因多态性的研究

　　　　作者：李居怡，金晶，高鹏，杜娟，王健

【摘要】 目的 研究高脂血症治疗的药物相关基因CYP2C9*3、甲硫氨酸合成酶(MSA2756G)在宁夏回族高脂血症患者中的分布及其与高脂血症的关系。方法 通过扩增引进限制性酶切位点(ACRS)和应用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术对高脂血症患者进行基因型分析。结果 180名宁夏回族高脂血症患者中，CYP2C9*3等位基因频率为3.33%，突变频率男性(3.05%)高于女性(0.28%)，差异有显著性(P<0.01)，而与健康对照组(3.00%)比较，差异无显著性(P>0.05);MSA2756G等位基因频率为15.83%，显著高于健康对照组(10.25%)(P<0.05)，未发现性别差异。结论 宁夏回族人群携带CYP2C9*3基因型的男性患高脂血症风险更大;MSA2756G可能是高脂血症的危险因子。

【关键词】 高脂血症;CYP2C9;甲硫氨酸合成酶;多态性;宁夏回族

　　ABSTRACT: Objective To investigate the distribution of CYP2C9*3 and methionine synthetase (MSA2756G) genes related to drug therapy in hyperlipidemia patients of Ningxia region as well as its relation with hyperlipidemia.Methods Genotype was determined by using amplicationcreated restriction sites (ACRS) and polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) in hyperlipidemia patients.Results Among the 180 hyperlipidemia patients of Ningxia Hui population， the frequency of CYP2C9*3 alleles was 3.33% and mutation rate in men (3.05%) was significantly higher than that in women (0.28%) (P<0.01). However， the indexes mentioned above did not differ from those of the healthy controls (3.00%) (P>0.05). The frequency of MSA2756G (15.83%) alleles was significantly higher than that in healthy control group (10.25%) (P<0.05)， but there was no difference between men and women.Conclusion Men in Ningxia region who carry CYP2C9*3 genotype have a higher risk of hyperlipidemia; MSA2756G mutation may be a risk factor for hyperlipidemia.

　　KEY WORDS: hyperlipidemia; CYP2C9; methionine synthase; polymorphism; Ningxia Hui population

　　高脂血症是促进动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要危险因素之一。合理的药物治疗能有效降低血脂，从而减少冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生概率。他汀类药物是新一代最有效的调血脂药[1]。据美国食品药品管理局数据显示，氟伐他汀是他汀类中毒事件发生最少的药物，其主要经肝脏细胞色素CYP2C9代谢清除，而基因突变可能会影响肝药酶的活性[2]。因此，CYP2C9基因多态性可能与高脂血症的发生有关。甲硫氨酸合成酶(MS)是同型半胱氨酸(homocysteine)再甲基化代谢途径的关键酶，而Hcy使机体产生高脂血症，可导致代谢疾病的发生，造成动脉粥样硬化[3]。因此，MS基因多态性有可能是高脂血症的危险因子。本研究旨在探讨宁夏回族人群CYP2C9*3、MSA2756G基因多态性分布及其与高脂血症的发生有无关联性。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 2007年1月至10月在宁夏回族自治区人民医院体检的健康回族志愿者200例，其中，男性100例，女性100例，年龄在(46.22±9.25)岁之间，体重指数在(25.22±3.99)kg/m2之间;高脂血症患者180例，其中，男性92例，女性88例，年龄在(45.06±8.96)岁之间，体重指数为(24.99±3.06)kg/m2之间，无其他内分泌疾病。高脂血症的诊断标准为：空腹血清中总胆固醇(TC)≥5.72mmol/L，甘油三酯(TG)

　　≥1.70mmol/L，受试者了解试验过程并签署知情同意书。

　　1.2 DNA样品的制备 抽取每位受试者静脉血3mL，采用北京赛百盛生物公司的硅胶膜基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

　　1.3 基因型的检测 采用扩增引进限制性酶切位点(ACRS)和聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术检测CYP2C9*3和MSA2756G的多态性分布;直接测序法验证基因型检测方法的可靠性。①CYP2C9*3引物[4]序列：上游5′TGCAC

　　GAGGTCCAGAGGTAC3′，下游5′AAACATGGAGTTGCAGTGTAG3′，扩增产物为131bp，扩增循环参数：反应体系25μL，94℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火60s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃再延伸5min，PCR扩增产物用5u限制性内切酶KpnⅠ在37℃消化过夜，40g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。基因型的判定方法：如酶切图谱显示为131bp一条带，则为CYP2C9*1*1野生型，如为131bp、110bp的条带(21bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认)，则为CYP2C9*1*3突变型杂合子，如仅显示110bp条带(21bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认，仅见110bp的条带)，则为CYP2C9*3*3突变型纯合子。②MSA2756G引物[5]序列：上游5′CATGGAAGAA

　　TATGAAGATATTAGAC3′、下游引物：5′GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA3′，扩增产物为189bp，扩增循环参数：反应体系25μL，94℃预变性5min，94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃再延伸7min，PCR扩增产物用10u限制性内切酶HaeⅢ在37℃消化过夜，40g/L琼脂糖凝胶电泳确定基因型。基因型的判定方法：如酶切图显示为189bp一条带，则为AA野生型，如为189bp、159bp的条带(30bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认)，则为AG突变型杂合子，如仅见159bp条带(30bp的条带在40g/L的琼脂糖凝胶上不能被辨认，仅见159bp的条带)，则为GG突变型纯合子。

　　1.4 统计学处理 计数各位点基因型频率和等位基因频率，采用SPSS 11.5统计软件分析，以χ2检验检测高脂血症患者与正常人群及男女性别之间的各等位基因频率的差异，高脂血症患者与正常人群年龄、体重间的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 基因型和等位基因的分布 本研究所筛选符合条件的高脂血症患者180例和正常对照组200例在性别、体重、年龄之间均无显著性差异(P>0.05)，具有可比性(表1);凝胶电泳图和测序图见图1、2，CYP2C9*3、MSA2756G等位基因的分布频率在高脂血症组分别为3.33%、15.83%(表2)。第5个碱基处有A、G重峰，碱基A比突变碱基G峰的信号强而显示绿色碱基A(图2C);被圈的碱基G，表示上游引物中引入错配碱基G成功(图2D、图2E)，而倒数第二个碱基显示为A，碱基A比突变碱基C峰的信号要强，而显示绿色碱基A。　表1 宁夏回族高脂血症患者与健康对照组基本情况的比较

　　2.2 各基因型与高脂血症的关系 在高脂血症患者组，CYP2C9*3的等位基因分布频率显示男性显著高于女性(3.05% vs. 0.28%)(P<0.01)，而CYP2C9*3等位基因分布频率在高脂血症患者组与健康对照组之

　　间无显著性差异(3.33% vs. 3.00%)(P>0.05)，CYP2C9*3与高脂血症无显著相关性;高脂血症患者组的MSA2756G等位基因分布频率显著高于健康对照组(15.83% vs. 10.25%)(P<0.05)，差异有统计学意义，MSA2756G等位基因与高脂血症有显著相关性;CYP2C9*3、MSA2756G之间的联合基因型在高脂血症患者组与健康对照组间经χ2检验，发现CYP2C9*3、MSA2756G联合基因型与高脂血症无关联性(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　CYP2C9是CYP2亚族中含量最丰富的酶，也是人类第一个得到结晶和分析反应底物的CYP[6]，它能代谢多种抗糖尿病药、抗生素、抗高脂血症、抗高血压药[78]。因此，CYP2C9基因多态性可能与高血压、高脂血症、冠心病、动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关。MSA2756G位点的遗传性缺陷可导致Hcy再甲基化受阻，引起血Hcy水平升高，而升高的Hcy和低密度脂蛋白结合，会造成胆固醇在细胞内堆积，最终会促进动脉粥样硬化的形成[9]。因此，MSA2756G多态性可能与高脂血症的发生相关。

　　在CYP2C9的开放读码框中发现10多个基因多态性，其中CYP2C9*3与野生型比较，代谢活性发生明显的改变，CYP2C9*3杂合子个体可降低S华法令的口服清除率的60%，CYP2C9*3纯合子个体降低S华法令的口服清除率可达90%[10]，ZANDVLIET等[11]研究发现CYP2C9*3多态性导致氨苯磺胺类药的消除率下降。因此，基因突变可能造成了CYP2C9酶的结构与功能的改变，最终导致CYP2C9酶活性降低或者丧失。本研究观察了宁夏回族地区

　　高脂血症患者他汀类药物降脂治疗相关的基因多态性位点CYP2C9*3的分布及其与高脂血症的关系。结果显示，CYP2C9*3在高脂血症患者中的分布频率为3.33%，与健康人群的分布频率(3.00%)无显著性差异(P>0.05)。但是，在高脂血症患者中，男性

　　患高脂血症的几率远高于女性(3.05% vs. 0.28%)，差异显著(P<0.01)，与文献[12]报道的相似，进一步证实雌激素对患高脂血症具有保护作用，雌激素通过增加低密度脂蛋白受体的表达，进而减少血液中低密度脂蛋白胆固醇，而孕激素也可以减少甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇。因此，妇女比起同龄的男性患高脂血症的风险要低[13]。表2 宁夏回族高脂血症患者与健康对照组人群中CYP2C9*3、MSA2756G基因型、等位基因分布频率的比较

　　人MS基因定位于染色体1q42.3～43，编码了长度为1265个氨基酸的多肽链，目前已发现10余种突变，以A2756G最为常见，即A2756G突变导致天冬氨酸取代了甘氨酸残基，从而产生了一个HaeⅢ内切酶的位点。MS的主要生化功能是催化同型半胱氨酸再甲基化为甲硫氨酸。因此，它是Hcy代谢途径中的一个关键酶。本研究显示MSA2756G在高脂血症患者中的分布频率为15.83%，与健康对照组(10.25%)比较，差异有显著性(P<0.05)，但无性别差异。文献[14]报道的高脂血症患者等位基因G的分布频率为9.6%，而正常对照组为7.0%。提示MS基因突变可能存在民族与地域的差异，也可能与样本例数有关。目前，有关MSA2756G与高脂血症的关系研究相对较少。然而，MSA2756G突变体是否对酶的活性发生了功能性的改变目前尚不清楚[15]。MSA2756G与高脂血症的关系还需通过MS酶活性的检测等作进一步地研究。

　　综上所述，CYP2C9*3、MSA2756G基因多态性在宁夏回族地区的分布与文献报道的其他地区或种族的分布存在明显差异，CYP2C9*3女性携带者患高脂血症的几率远低于男性，而MSA2756G等位基因可能是高脂血症的高风险因素。这为宁夏回族地区高脂血症患者的个体化用药产生了积极的意义。

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