作者：陶洪，王琳，侯铁舟，张珑，王雪绒
【摘要】 目的探讨氟对小鼠釉原蛋白基因表达的影响。方法在建立小鼠中度及重度氟斑牙模型的基础上，应用原位杂交技术检测对照组(饮用去离子水)、低氟组(饮水F-浓度为50mg/L)、高氟组(饮水F-浓度为150mg/L)小鼠下切牙发育过程中釉原蛋白mRNA在成釉细胞增殖分化期﹑分泌期﹑成熟期的表达情况。结果小鼠釉原蛋白mRNA在成釉细胞增殖分化期表达为阴性，分泌初期细胞内及新生釉基质中开始出现弱阳性表达;至分泌期，细胞内及新生釉基质中均呈强阳性表达;成熟釉质中无釉原蛋白mRNA的阳性表达。低氟组釉原蛋白mRNA在新生釉基质表面呈强弱交替的不均匀表达;高氟组釉原蛋白mRNA在新生釉基质表面及矿化釉质中均呈阳性表达;在成釉细胞分泌期，其表达多次中断。结论氟影响釉原蛋白mRNA在成釉细胞、釉基质中的表达，过高浓度的氟周期性抑制成釉细胞分泌釉基质的功能，从而导致釉质的矿化不全、矿化不均及局灶性缺损。
【关键词】 氟;秞原蛋白;原位杂交
ABSTRACT: ObjectiveTo study the effect of fluorine on the amelogenin gene expression of mus musculus incisors.MethodsOn the basis of establishing a model for medium- and high-level dental fluorosis of mus musculus， this research analyzed the space-time expression of amelogenin in inferior incisor growth period of mus musculus by using in situ hybridization.ResultsAmelogenin mRNA was negative under the microscope in the ameloblast proliferation differentiation period， and it showed weakly positive expression in intra-cellular and new-birth enamel matrix at the initial secretion stage but it showed strongly positive expression in intra-cellular and new-birth enamel matrix when it came to secretion phase. There was no positive expression of amelogenin mRNA at the mature stage. In low-fluorine group (the concentration of F- in drinking water was 50mg/L)， amelogenin mRNA showed strongly positive and weakly positive expression alternately on the surface of new-birth enamel matrix under the microscope. In high-fluorine group (the concentration of F- in drinking water was 150mg/L)， amelogenin mRNA showed positive expression on the surface of dentoenamel junction of new-birth enamel matrix and mineralized enamel under the microscope.ConclusionOverdose fluorine can affect the expression of amelogenin mRNA of ameloblast and enamel matrix， and it can intermittently influence the exudation of enamel matrix at the same time. Then， it will induce ill mineralization of enamel， unsymmetrical mineralization and focal damnification.
KEY WORDS: fluorine; amelogenin; in situ hybridization
氟牙症发病机制的研究已取得了相当程度的进展，但氟对釉质蛋白基因表达的研究才刚刚起步。尽管釉基质蛋白潴留可以解释釉质矿化不良，但却无法解释釉质不均匀的矿化不全以及牙齿表面局灶性釉质发育不全、牙齿窝沟变浅、牙本质钙化不良等现象。如果能够证实氟使得牙胚成釉细胞出现不均匀的分化、增殖和釉质蛋白基因表达功能异常，将有助于对上述问题的解释。因此，本实验采用原位杂交技术，研究过量氟对牙釉质发育过程中起关键作用的釉原蛋白基因时空表达的影响，旨在从分子水平上进一步探讨氟牙症的发病机理，为氟牙症的预防提供新的理论依据。
1材料与方法
1.1小鼠氟牙症动物模型的建立
1.1.1实验动物及分组30只ICR雄性小鼠，体重18～22g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。动物随机分为对照组、低氟组、高氟组，每组10只。
1.1.2动物饲养及处理动物适应性饲养1周。1周后，对照组、低氟组、高氟组小鼠饲以常规饲料;对照组饮用去离子水，低氟组饮水投50mg/L氟(F-)，高氟组饮水投150mg/L F-，饲养42d。饲养期间每天观察大鼠的一般状态及牙齿变化，每10d称重;至第42天存活小鼠28只(高氟组死亡2只)。脱颈处死所有小鼠，解剖分离下颌切牙及其牙胚组织，置于40g/L多聚甲醛(含1mL/L DEPC)中固定24h。
1.2标本制备参照侯铁舟[1]氟牙症10类分级标准，选取小鼠氟牙症4～5级(轻度)，9～10级(重度)下切牙，常规脱钙包埋，标本做5μm连续切片。
1.3原位杂交釉原蛋白(amelogenin)原位杂交检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。探针序列：5′-GGTACCAGAGCATGATAAGGCAGCCGCATCCCCCG-3′;5′-CA-CCACTCCATGACTCCAACCCAACACCATCAG-CC-3′;5′-CATCAGCCCATGCAGCCCCAGTCACCTCTGCATCC-3′。常规原位杂交，阴性对照不加探针。
1.4结果判定釉原蛋白mRNA表达呈细胞胞质着色，阳性显色为棕黄色颗粒。每张切片随机选择不重叠的10个视野，根据细胞的染色强度分成4级：无阳性细胞为阴性(-);阳性细胞<25%为弱阳性(+);阳性细胞<75%为阳性();阳性细胞>75%为强阳性()。
1.5统计学方法应用SPSS15.0统计软件处理数据。各组间釉原蛋白mRNA的表达水平采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组小鼠氟牙症分级情况参照侯铁舟[1]根据小鼠切牙牙釉质表面的不同改变对氟牙症的10类分级标准，1～3级定为极轻、4～5级为轻度、6～8级为中度、9～10级为重度，我们分别将各组小鼠的氟斑牙程度进行了分级。低氟组中小鼠的氟牙症程度为2级、3级各有1只，7只小鼠氟牙症程度为4～5级，占小鼠总数的70%，程度为6级的有1只小鼠。高氟组中有6只小鼠氟牙症程度达到了9～10级，占小鼠总数的75%，另外氟牙症程度为7级和8级各有1只小鼠。因此，本实验采用50mg/L F-及150mg/L F-溶液建立中、重度氟斑牙动物模型是合理的。
2.2釉原蛋白mRNA在小鼠下切牙牙胚中的时空定位表达
①增殖分化期。对照组：小鼠切牙唇侧基底部末端成釉器细胞无规则、紧密排列，细胞呈椭圆形，核深染，核大，胞质少。此期未见釉原蛋白mRNA阳性染色。低氟组：与对照组无明显差别，牙胚中未见釉原蛋白mRNA阳性染色。高氟组：与对照组无明显差别。牙胚中未见釉原蛋白mRNA阳性染色。②分泌初期。对照组：内釉上皮细胞逐渐向星网状层整齐排列，呈矮柱状，单层排列在基底;细胞高度随细胞分化程度逐渐增加，细胞核开始极化。内釉上皮细胞从牙尖部开始随着细胞的分化先后出现弱阳性染色，染色逐渐增强。同时有少量的釉基质分泌形成，釉原蛋白mRNA在釉基质中开始出现弱阳性表达。低氟组：细胞高度渐增加，细胞核开始极化。随着细胞的分化趋于成熟，细胞中先后出现釉原蛋白mRNA的弱阳性染色，釉基质亦开始形成，釉原蛋白mRNA在新生釉基质中呈现弱阳性表达。高氟组：成釉细胞矮柱状，高度随细胞分化程度逐渐增加，细胞核开始极化，随细胞的分化，成釉细胞中先后出现釉原蛋白mRNA弱阳性染色;有少量釉基质形成，釉基质中可见釉原蛋白mRNA阳性染色。③分泌期。对照组：成釉细胞已分化成熟并分泌釉基质蛋白成分，细胞高柱状排列，细胞核远离基底膜;成釉细胞牙本质侧的Tomes突整齐排列;成釉细胞染色增强为强阳性，棕黄染色的釉原蛋白mRNA呈颗粒状位于细胞质中，并从Tomes突分泌至细胞外;釉质基质边缘为锯齿状，可见釉原蛋白mRNA颗粒密集呈线状较均匀分布于新生釉基质中。釉基质厚度逐渐增加，并逐渐矿化，呈现晶体状，排列均匀整齐。深层釉质中无釉原蛋白mRNA的阳性染色;靠近釉牙本质界的釉质中有釉原蛋白mRNA弱阳性染色。随着釉质成熟，成釉细胞高度逐渐降低，釉原蛋白mRNA染色下降，保持在较低水平。成熟釉质中无釉原蛋白mRNA阳性染色(图1A)。低氟组：成釉细胞分化成熟，细胞呈高柱状排列，细胞核极化明显，但部分细胞有扭曲变形;成釉细胞排列紊乱的区域釉牙本质界模糊，局部釉基质与牙本质基质相接处出现囊样腔隙。牙本质侧的Tomes突排列较为紊乱，局部有空泡出现;釉原蛋白mRNA呈颗粒状位于细胞质中，从Tomes突分泌至细胞外釉原蛋白mRNA在新生釉基质表面分布不均匀;与对照组同期相比，釉原蛋白mRNA在成釉细胞中的阳性表达率下降(图1B)。高氟组：成釉细胞高度存在明显差异，成釉细胞排列紊乱，大部分细胞扭曲变形，正常的柱状形态丧失;细胞核极化远离基底膜;胞质内出现空泡;Tomes突不规则，甚至完全缺失;棕黄染色釉原蛋白mRNA呈颗粒状位于胞质中。与对照组、低氟组同期相比，釉原蛋白mRNA在成釉细胞中的阳性表达率均低于前两组;釉基质分泌异常，与对照组和低氟组相比，基质高度降低，并且基质分布不均，呈明显节律性。新生釉基质中可见釉原蛋白mRNA强阳性表达;局部釉基质凝聚成团块状，其内釉原蛋白mRNA阳性染色;釉基质与牙本质基质之间出现囊样腔隙;釉质晶体排列不规则，无正常晶体形态(图1C)。图1各组釉原蛋白mRNA的表达Fig.1 The expression of amelogenin mRNA in each group (in situ hybridization)A：对照组(×200);B：低氟组(×400);C：高氟组(×400)。
2.3各组釉原蛋白mRNA表达水平的比较釉原蛋白mRNA在对照组、低氟组、高氟组成釉细胞的增殖分化期表达均为阴性;分泌初期开始出现弱阳性表达;至分泌期，增强呈强阳性表达。对照组釉原蛋白mRNA在矿化釉质中表达阴性，低氟组矿化釉质中釉原蛋白的基因表达呈弱阳性，而在高氟组为阳性表达(表1)。将对照组、低氟组、高氟组釉原蛋白mRNA表达水平进行两两比较，结果表明，增殖分化期与分泌初期各组釉原蛋白mRNA表达水平无统计学差异，至分泌期，两组表达水平的差异有统计学意义(表2)。表1对照组、低氟组和高氟组釉原蛋白mRNA的表达表2对照组、低氟组和高氟组釉原蛋白mRNA表达水平的统计分析
3讨论
在我们所建立的轻度氟中毒小鼠模型中，肉眼观下切牙虽然表面并无明显的釉质缺损，但有或宽或窄的白垩色矿化不良区与矿化较好的釉质条带相交替。镜下观牙胚中釉原蛋白mRNA的表达与对照组不同之处在于，釉原蛋白mRNA在釉基质表面的某些区域呈现强阳性表达与弱阳性表达交替出现。在釉质的发育及矿化过程中，釉原蛋白起着举足轻重的作用，它为釉质的生物矿化提供必要支架，有助于引导未成熟晶体沿正确的方向生长。而在成熟阶段，釉原蛋白被成釉细胞分泌的釉质蛋白酶逐渐降解、清除，以解除其对晶体生长的抑制，并为晶体生长提供必要的空间[2-3]。滞留于釉质中的蛋白会附在釉质晶体表面阻碍晶体的进一步矿化，以致矿化不全。以往的诸多研究均表明，氟影响着釉质蛋白的降解清除，致使釉质蛋白不能完全被移除，比如氟影响了釉基质中的pH值，氟可降低釉质蛋白酶的分泌量及酶活性等[4-5]。可是以上这些研究都不能解释氟牙症中釉质的矿化不均这一现象。本实验表明，在50mg/L F-作用下，釉原蛋白mRNA的表达存在增强与减弱相交替的现象。mRNA的表达水平往往反映了蛋白质的表达水平，由此我们推断，在釉原蛋白mRNA表达增强的区域釉原蛋白的表达是相对较高的，氟的存在使酶降解釉质蛋白的能力降低，因此不能对其产生完全的降解清除，蛋白滞留于釉质中，造成该部位的釉质矿化不全。而在表达较弱的区域，釉原蛋白的表达亦相对低，釉原蛋白被降解的较彻底，相应部位的釉质矿化比较完全。高春娜等[6]利用实时定量聚合酶链反应(PCR)观察过量氟对大鼠下切牙釉原蛋白表达的影响，实验结果显示，实验组大鼠下切牙釉原蛋白的表达低于对照组。推测过量氟可能通过抑制釉原蛋白的表达来影响釉质发育。
在重度氟中毒模型中，我们可见到小鼠的下切牙釉质表面出现了局灶性的缺损，镜下观察其牙胚，成釉细胞排列紊乱，细胞的分化程度时高时低，分化不均。在分化程度相对较好的区域，可见到有釉基质形成，釉基质表面及矿化釉质中都有釉原蛋白mRNA的阳性表达。在细胞分化程度较低的区域，细胞下方仅有极少量的釉基质。整个牙胚中见到的釉基质形态呈节律性变化。以此看来，高浓度氟(150mg/L F-)严重影响了成釉细胞的分泌功能，甚至使部分成釉细胞基本丧失了分泌釉基质的能力。这一结论提示，在重度氟牙症中所出现的釉质局灶性缺损可能正是由于氟对成釉细胞的破坏作用使局部釉基质分泌受到抑制，进而出现釉质的缺损。另外，在矿化釉质中有釉原蛋白mRNA的阳性表达，同样因氟抑制了釉原蛋白的降解清除，釉原蛋白潴留，致使釉质矿化不全。
本实验中，在低浓度F-(50mg/L F-)影响下，小鼠牙面呈现白垩色与半透明条带相交替，镜下观察其牙胚，釉原蛋白基因表达时强时弱，提示氟使釉原蛋白基因的不均匀表达可能是造成氟斑牙釉质不均匀矿化的原因之一。BRONKERS等[7]研究表明，在离体条件下，F-浓度即使高达1.31mmol/L(25mg/L)时，分泌前期的成釉细胞仅受极小的影响，高氟浓度可使分泌期的成釉细胞出现肿胀变性，基质分泌异常。本实验表明，高浓度F-(150mg/L F-)周期性地抑制成釉细胞分泌釉基质的功能，不仅使釉基质的分泌量减少，而且在某些部位造成成釉细胞的分泌功能几乎完全丧失;与此同时，釉基质中的釉原蛋白基因表达强度较高。究其原因，可能是在氟抑制成釉细胞分泌釉基质的同时，还抑制了细胞分泌蛋白水解酶的功能，使釉基质中的蛋白基因表达强度异常，以致釉质的矿化异常。推测，重度氟牙症中的釉质局灶性缺损与釉质矿化不全可能与高氟对成釉细胞分泌功能的损伤有着十分密切的联系。
参考文献
\[1\]侯铁舟，郭海燕，陶洪，等. 小鼠氟牙症分级标准的建立 \[J\]. 国际口腔医学杂志， 2009， 36(2)140-143.
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\[7\]BRONCKERS AL， BERVORTS TJ， LYARUU DM， et al. Fluoride enhances intracellular degradation of amelogenins during secretory phase of amelogenesis of hamster teeth in organ culture \[J\]. Connect Tissue Res， 2002， 43(2-3):456-465.