作者：张广健 高蕊 付军科 金鑫 张明鑫 王健生
【摘要】 目的分析食管癌多药耐药基因(MDR1)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达的相关性及探讨其与临床病理间的关系。方法应用实时定量PCR(QRT-PCR)及Western blot对34例食管癌及癌旁组织标本的MDR1及HIF-1α表达水平进行检测。结果34例食管癌组织的MDR1表达显著低于癌旁组织(P<0.05)，但高于正常组织(P<0.05)。而HIF-1α在癌组织的表达水平则显著高于癌旁组织(P<0.05)。两基因表达水平存在正相关关系(P<0.01)。HIF-1α、MDR1表达均与食管癌的分化程度呈正相关。结论MDR1、HIF-1α的表达在食管癌及癌旁组织中均明显上调。HIF-1α可能通过诱导MDR1表达导致食管癌化疗耐药。
【关键词】 多药耐药基因;缺氧诱导因子;食管癌
ABSTRACT: ObjectiveTo explore the expressions of multidrug resistance gene (MDR1) and hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) in human esophageal cancer and the correlation between them as well as clinical pathological factors.MethodsBiopsy samples from 34 esophageal cancer patients were used. The mRNA and protein levels of MDR1 and HIF-1α were measured by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (QRT-PCR) and Western blot analysis， respectively.ResultsThe MDR1 expression level of cancerous tissues was significantly lower than that of tissues adjacent to the carcinoma site (P<0.05). However， the level of HIF-1α expression in cancer tissues was much higher than that in the paratumor tissues (P<0.05). There was a positive correlation between HIF-1α and MDR1 expressions. HIF1α and MDR1 levels were both correlated with clinical stage of esophageal cancer. ConclusionMDR1 and HIF-1α are over-expressed in esophageal cancer and in tissues adjacent to the carcinoma site simultaneously. The modulation of MDR1 expression is probably dependent upon the expression of HIF-1α.
KEY WORDS: multidrug resistance gene (MDR1); hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α); esophageal cancer
食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，预后较差。50%～60%的患者就诊时已有远处转移，中位生存期4～8个月。虽然近年来化疗方案的改善可以使中晚期食管癌的化疗有效率得到提高，但总的5年生存率仍低于20%[1]。化疗耐药(multidrug resistance， MDR)是导致食管癌药物治疗失败的根本原因。因此，研究食管癌MDR机制是提高其化疗效果最关键一步。缺氧是实体肿瘤生长的微环境特征之一。肿瘤内部总处于相对缺血缺氧的微环境。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1， HIF-1)是缺氧环境下被激活的重要转录因子，其受氧调节的亚基HIF-1α对化疗耐药基因MDR1表达的调控作用受到越来越多的关注。但是，两者的相关性至今未在食管癌组织中得到证实。本文即在mRNA及蛋白水平研究MDR1与HIF-1α在34例食管癌组织中的表达变化及相关性，进而探索其在食管癌中的表达与临床病理特性之间的关系。
1材料与方法
1.1材料西安交通大学医学院第一附属医院2005年9月至2009年6月手术切除的食管癌组织标本34例。其中男23例，女11例，年龄30～70岁。按UICC 1997年标准分期，T1～T2期19例，T3～T4期15例;N0 20例，N1 14例;Ⅰ期9例，Ⅱ期8例，Ⅲ期17例。采集方法：术后0.5h内采集同一患者食管癌组织及癌旁组织。作为对照的正常组织取自上述标本中距肿瘤边缘5cm以上的食管上皮。新采标本由DEPC处理后冻存管分装、液氮运送并立即冻存于-80℃冰箱待用。标本性质均经术后病理证实。
1.2试剂与仪器DEPC购自Amresco公司;Trizol购自Invitrogen公司;RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit试剂盒购自Fermentas公司;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ为TaKaRa公司产品。PCR引物由Augct Biotechnology公司合成。HIF-1α、P-gp抗体均购自Abcam公司，β-actin抗体为Santa Cruz公司产品。辣根酶标记羊抗小鼠lgG试剂盒购自北京博奥森公司，BCA蛋白定量试剂盒购自珠海健康元;5810R高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品;CE2301微量核酸蛋白定量仪为Genequest公司产品;iQ5 Real-Time PCR cycler购自Bio-Rad公司。
1.3实验方法①RNA的提取和互补。按照Trizol试剂说明书操作，并测定RNA浓度及A值，A值在1.8～2.0之间，经10g/kg琼脂糖电泳观察RNA质量。②荧光定量RT-PCR。每20μL逆转录体系加入总RNA 1μg，合成cDNA第一链，反应条件为30℃ 10min，42℃ 30min，95℃ 5min，5℃ 5min。合成20μL反应体系：cDNA 2μL，上、下游引物各1μL，SYBR Green I Pre-mix1 2.5μL，水8.5μL补足20μL。95℃ 10min，95℃ 15s，53.3℃ 30s，72℃ 30s，45个循环。引物序列及退火温度见表1。扩增后以溶解曲线及10g/L琼脂糖电泳分析其特异性，每个样本至少重复3次。③Western blot用细胞裂解液溶解细胞后提取全细胞蛋白并定量。取50μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，并转至硝酸纤维膜上。50g/L封闭液室温封闭2h后用含0.5mL/L Tween 20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次，每次10min。加入P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、HIF-1α及β-actin一抗(HIF-1α 1∶500;P-gp 1∶200;β-actin 1∶5000)，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)，37℃摇床温育2h。增强化学发光显色系统的显色效果。以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照，每个样本至少重复3次。表1HIF-1α、MDR1及β-actin引物序列、扩增片段大小及退火温度
1.4结果判定QRT-PCR结果分析方法：记录每个标本的目的基因CT值和内参照CT值，根据荧光定量PCR相对定量统计方法，癌组织中目的基因相对于内参照基因的拷贝数为2-△CT，△CT=CT癌组织目的基因-CT癌组织内参照基因;正常目的基因相对于内参照基因的拷贝数为2-△CT，△CT =CT正常组织目的基因-CT正常组织内参照基因。运用凝胶成像仪(基因公司)对Western blot结果进行图像分析，计算条带的积分吸光度(IA)。IA=A均值×面积。采用所测P-gp及HIF-1α条带与β-actin条带IA比值来表示P-gp及HIF-1α蛋白的含量。
1.5统计学处理所有实验数据以±s表示，使用SPSS12.0软件进行数据分析。癌组织和癌旁组织、正常组织的mRNA及蛋白表达水平比较采用One-Way Anova，组间两两比较为SNK法。HIF-1α与MDR1表达的相关性采用Pearson相关系数进行检验。所测mRNA、蛋白表达水平与临床病理因素间的相关性采用独立样本t检验完成。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HIF-1α与MDR1 mRNA的表达水平HIF-1α在癌组织中扩增曲线的总体CT值在癌旁组织之前。行统计分析显示HIF-1α mRNA在癌组织细胞中的表达明显高于癌旁组织(P<0.05)。与HIF-1α相反，MDR1在癌旁组织中的测定值显著高于癌组织(P<0.05)。两种基因在正常组织中的表达水平均显著低于其在癌组织及癌旁组织的测定值(P<0.05，表2)。在mRNA水平HIF-1α与MDR1存在正相关关系(rs=0.591，P<0.01)。
2.2HIF-1α蛋白与P-gp的表达水平与mRNA检测结果一致，HIF-1α蛋白在食管癌组织内的表达水平显著高于癌旁组织与正常组织(P<0.05)。而P-gp则是在癌旁组织内的表达水平最高(表3)。HIF-1α蛋白与P-gp间亦呈正相关关系(rs=0.683，P<0.01)。表2各组HIF-1α与MDR1 mRNA的表达水平的比较
2.3食管癌组织HIF-1α和MDR1表达与临床病理因素的关系对癌组织HIF-1α表达与临床病理间的关系进行研究，发现有淋巴结或远处转移者较无转移者表达水平显著增高(P<0.01)，分化程度低者的检测结果明显高于中、高度分化者(P<0.05)，没有发现HIF-1α表达与病理分期及浸润程度有联系(P>0.05)。对MDR1与临床病理的关系进行研究，发现其表达仅与肿瘤组织分化程度有关(P<0.01，表4)。表3各组HIF-1α蛋白与P-gp表达水平的比较
3讨论
我国是食管癌的高发地区，食管癌校正死亡率达20.4/10万，居世界首位。大多数食管癌患者就诊时已出现远处转移，失去手术机会。近年来研究认为食管癌的高度恶性生物学行为与肿瘤缺氧有密切关系。
缺氧诱导因子HIF-1α是调节肿瘤细胞适应缺氧的核心转录因子，参与缺氧过程中多种基因的转录调控。本研究采用食管癌瘤体组织作为研究对象，结果提示食管癌组织HIF-1α mRNA表达高于癌旁组织及正常组织，癌组织HIF-1α蛋白水平亦明显升高。这与以往的报道一致[2]。对于其高表达原因，多数报道认为是由于癌组织生长过快，血供不足造成的缺氧状态使HIF-1α mRNA表达水平升高;同时缺氧也导致HIF-1α蛋白降解减少，稳定性提高。KIMA等[3]则认为ERK、P38通路对HIF-1α mRNA转录和翻译的上调作用也是导致表达升高的原因之一。
既往研究发现，食管鳞状上皮中、重度异型增生组织中即存在HIF-1α表达，而正常上皮组织和轻度异型增生组织中不存在其表达。提示并非在肿瘤生长到明显缺氧以后才有HIF-1α基因表达上调，在食管鳞癌发生前期和早期就会出现HIF-1α基因表达上调。本实验发现在癌旁组织HIF-1α表达就出现增多，表明 HIF-1α的高表达在有肿瘤侵袭的组织学证据之前就已存在。
KUROKAWA等[4]的研究表明，食管癌组织中HIF-1α的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈正相关。而李世栋等[5]的结果则提示HIF-1α表达与肿瘤浸润深度有关，与组织分化程度和淋巴结转移无关。本实验在蛋白和基因水平上证实HIF-1α与淋巴结转移、远处转移及肿瘤分化级别有联系。这一结果支持KUROKAWA等的观点。提示HIF-1α可能是肿瘤恶性程度的一个指标。
多药耐药机制几乎存在所有耐药肿瘤中，国内外文献多有报道食管癌组织MDR1表达增加[5-6]。本研究表明在mRNA及蛋白水平食管癌MDR1表达均高于正常组织，与之前的大多研究结果一致。然而，从本组癌旁食管黏膜及癌组织MDR1表达情况来看，食管癌组织MDR1表达低于癌旁组织，这在以往文献中尚未见报道。P-gp在组织中的表达主要是起保护细胞的功能。由此我们推论，化疗时癌旁组织会对食管癌组织提供重要保护作用，进而导致化疗耐药出现。提示治疗中不仅要针对癌组织，同时对癌旁组织的这种保护作用也应做出处理。可能的话，应选用合适的已被临床证明有效的MDR1基因逆转剂或P-gp阻断剂进行联合应用，才能使化疗发挥更有效的作用。
本组患者术前均未接受任何形式的肿瘤化疗，但在食管癌及癌旁组织中呈现MDR1表达的明显增高，属于肿瘤的内源性MDR。这种内源性耐药多发生在组织分化不良型癌肿中，MDR1高表达是分化不良型癌肿的特征之一[6]。我们的研究发现，食管癌组织的MDR1表达与食管癌的分化程度相关，与癌组织浸润深度及淋巴结转移无关。提示MDR1表达体现了肿瘤组织分化不良的生物学行为，但不能反映食管癌的浸润深度及淋巴结转移等特征。
既往对结肠癌、肝癌、肺腺癌、卵巢癌以及胃癌等的研究表明缺氧会导致肿瘤耐药，对前列腺癌多细胞球体的研究亦证实缺氧对MDR的关键作用[7-10]。对HIF-1α基因沉默则可以显著减低MDR1的表达，提示MDR1可能是HIF-1α的应答基因[11]。然而，HIF-1α对MDR1的这种作用至今未在食管癌细胞上得到证实。需要指出的是，针对这两种基因相互作用的研究也有得出不同结论的报道。THEWS等[12]的研究就表明缺氧仅对MDR1表达有微弱的调节作用。本次对34例食管癌组织及癌旁组织的研究结果表明在基因及蛋白水平，MDR1与HIF-1α间均为正相关关系。随着HIF-1α的表达上调，食管癌细胞的耐药基因表达也出现增高。这与大多数报道一致。提示缺氧是食管癌化疗耐药的重要诱导因素，在治疗方案的确定中应予以考虑。
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