作者：刘青松，凡瞿明，蒋红，朱兴春，邢艳，唐中
【摘要】 目的探讨丹参对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞凋亡的影响。方法类风湿关节炎患者关节滑液经原代培养，应用3～5代传代的成纤维样滑膜细胞，分为3组，分别为高剂量丹参组(丹参终浓度为50mg/mL)、低剂量丹参组(丹参终浓度为0.39mg/mL)和溶剂对照组，采用流式细胞术结合AnnexinV/FITC和PI双标记染色检测细胞凋亡率。结果与对照组比较，高剂量丹参组和低剂量丹参组细胞凋亡率均较对照组明显增加(P<0.05)，并且高剂量丹参组细胞凋亡率明显大于低剂量丹参组(P<0.05)。结论丹参能有效诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡。
【关键词】 丹参;类风湿关节炎;成纤维样滑膜细胞;凋亡
ABSTRACT: ObjectiveTo explore the effect of salvia miltiorrhiza on the apoptosis of fibroblast-like synoviosytes (FLSs) from patients with rheumatoid arthritis (RA).MethodsFLSs were harvested from RA patients by primary culture joint synovial fluid and through 3-5 passages. After treated with salvia miltiorrhiza for 24h， cells were pided into high-dose (salvia miltiorrhizas final concentration of 50mg/mL)， low-dose (salvia miltiorrhizas final concentration of 0.39mg/mL) and solvent group. The apoptosis of RA FLSs was detected by AnnexinV/FITC and PI with flow cytometry (FCM).ResultsCompared with that in control group， cell apoptosis rate in high-dose and low-dose groups treated with salvia miltiorrhiza was significantly increased (P<0.05)， and it was significantly greater in high-dose group than in low-dose group (P<0.05).ConclusionSalvia miltiorrhiza can effectively induce the apoptosis of fibroblast-like synoviosytes from rheumatoid arthritis patients.
KEY WORDS: salvia miltiorrhiza; rheumatoid arthritis; fibroblast-like synoviocyte; apoptosis
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种以滑膜增生为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，其原因之一为成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes， FLSs)数量增加和形态改变，并侵蚀邻近的软骨和骨组织[1]。研究证实FLSs在RA病程发展过程中具有独特的作用[1]。FLSs在RA持续炎症发展和血管发生中具有重要作用[2-4]。丹参为中国的传统中药，最早见于《神农本草经》，常用于治疗冠心病及缺血性脑血管病，且疗效颇佳，已被现代临床实验和药理实验研究所证实具有活血化瘀、诱导肿瘤细胞凋亡等多方面的药理活性[2-3]。近年来，已有应用丹参治疗RA的报道，并取得满意的效果[4-5]，但对丹参治疗RA的机制鲜有报道。由于RA FLSs具有肿瘤细胞特性，本实验从丹参能诱导肿瘤细胞凋亡的特点出发，探讨丹参对RA FLSs凋亡的影响。
1材料与方法
1.1材料在川北医学院附属医院类风湿科就诊的有膝关节积液的RA患者5例，其中男2例，女3例，年龄27～64周岁，平均年龄46.5周岁。所有患者均符合美国风湿病学会1987年的RA诊断标准。滑膜细胞分离自患者滑液，经体外培养获得。DMEM培养基(Gibco BRL公司);胎牛血清(HyClone北京生物化学制品有限公司);胰酶;Annexin V/PI 凋亡试剂盒(ABGAB，美国);注射用丹参[冻干](哈药集团中药二厂，成分为丹参，生产批号：090313);流式细胞仪(Becton Dickinson);倒置显微镜(OLYMPUS IX71)。
1.2方法
1.2.1滑膜细胞的分离与培养采用滑液中的游离滑膜细胞进行培养。患者在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，在4℃，1000r/min离心10min，去上清后用无菌冷PBS 10mL悬浮细胞，经100目尼龙网过滤去除凝块沉渣，细胞再用冷PBS洗2次后，悬浮于DMEM培养液(含100mL/L胎牛血清，1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素)，混匀后取10μL行台盼蓝染色，活细胞计数。将收集到的细胞接种于培养皿，置50mL/L CO2自动控制培养箱，于37℃培养12h后更换培养液，去除非贴壁细胞，重复2～3次，至倒置显微镜下观察，细胞呈梭状成纤维样细胞 (图1A)。用胰蛋白酶法收集滑膜细胞，按细胞密度5×105/L复种于25cm2塑料培养瓶中。所有用于FCM检测的细胞为3～5代生长稳定的成纤维样滑膜细胞。
1.2.2分组根据前期研究发现丹参终浓度为50mg/mL时TNF-α表达显著降低，且当丹参终浓度为0.39mg/mL时细胞形态开始出现改变。因此，将每一病例来源细胞分为高剂量丹参组、低剂量丹参组和对照组(丹参终浓度为50、0.39、0mg/mL)。
1.2.3细胞形态学观察将丹参处理前后的细胞直接置于倒置显微镜下观察，比较丹参处理前后的细胞数量、形态、大小以及细胞核形态的特点。
1.2.4流式细胞术分析细胞凋亡采用流式细胞术(flow cytometry， FCM)结合AnnexinV/FITC和PI双标记染色检测细胞凋亡率。待培养瓶细胞融合后(48～96h)，分别加入浓度为50、0.39和0mg/mL丹参注射液并继续培养24h。用2.5g/L的胰酶(不含EDTA)消化1min左右，收集细胞，用冷PBS洗涤2次。按照AnnexinV/FITC试剂说明书操作，主要步骤如下：配制1×binding buffer，并用此buffer重悬细胞。按照约1×106细胞加5μL FITC，室温避光孵育15min后，再加10μL PI继续孵育5min，随即进行FCM分析。
1.2.5统计学处理细胞凋亡率以均数±标准差(±s)表示，以丹参浓度为0mg/mL作为对照，采用SPSS 10.0作One way ANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1滑膜细胞的形态学改变经过反复贴壁与传代后，3～5代滑膜细胞逐渐纯化，主要以成纤维样细胞为主，体外生长稳定，镜下观察细胞形态基本为长梭形，少数为星形、多角形，胞质透亮、均匀，核居中，排列有局部方向性(图1A)。
光镜下可见高浓度丹参组、低浓度丹参组处理24h后，RA滑膜细胞细胞密度均一定程度降低;细胞形态也发生相应改变。在低浓度丹参组，细胞体积缩小明显，由梭形变成了不规则形或圆形，部分由贴壁变为悬浮，细胞核出现固缩，细胞核膜完整(图1B);而在高浓度丹参组，细胞体积变化不明显，以不规则形细胞多见，大部分细胞呈悬浮状，细胞透明性加强，细胞核突出、清晰，染色质致密，核内可见颗粒样物质，胞膜核膜完整(图1C。)图1滑膜细胞的形态学改变Fig.1 Morphous of RA FLSs under the optical microscope (10×20)A：对照组;B：0.39mg/mL丹参处理24h组;C：50mg/mL丹参处理24h组。
2.2丹参诱导RA FLSs凋亡丹参能明显诱导RA FLSs凋亡。经Annexin V/PI染色进行FCM检测各组凋亡细胞(图2)，以右上和右下象限为凋亡细胞，RA FLSs经0.39mg/mL和50mg/mL的丹参处理后的凋亡率由正常的(4.45±3.09)%分别上升到(13.58±3.26)%和(89.25±6.26)%，较正常组均有显著性差异(P值均小于0.05);高浓度丹参组比低浓度丹参组凋亡也明显增加(P<0.05)。说明丹参具有诱导RA FLSs凋亡的作用，且其诱导能力具有浓度相关性。图2经Annexin V/PI染色后的FCM散点图Fig.2 The scatter plot of flow cytometry of RA FLSs stained by Annexin V/PI A、C：对照组;B：0.39mg/mL丹参处理组;D：50mg/mL丹参处理组。
2.3丹参致RA FLSs坏死根据Annexin V/PI流式结果，以左上区为坏死细胞区域，在低剂量丹参组中，坏死细胞率达到了(23.08±2.59)%，比对照组(7.13±6.79)%显著增加(P<0.05);而高剂量丹参组，其坏死率(0.37±0.33)%明显降低(P<0.05)。
3讨论
RA的早期病变主要在滑膜，滑膜过度增生、增厚是造成关节损害的主要病理基础之一。越来越多研究表明引起RA关节膜组织过度增生导致关节畸形的基本原因可能与滑膜细胞凋亡障碍，使滑膜组织细胞的增殖和死亡间的平衡失调有关[6-7]。
FLSs作为RA滑膜细胞中最主要的一种，凋亡不足与RA滑膜增生密切相关，在RA发病中起重要作用。丹参系唇形科多年生草本植物，为我国代表性的活血化瘀中药，其已知的药效成分有丹参酮、丹参酚和丹参素等[6]。近年的研究发现，复方丹参注射液具有很强的抗氧化作用，能提高过氧化物歧化酶(SOD)活力，清除氧自由基，使单核巨噬细胞、中性粒细胞活化降低，抑制脂质过氧化和抗氧化损伤，从而对抗体内氧自由基对组织细胞的损伤;同时可以增加动物对缺氧环境的耐受力[7]。研究已证明丹参对肿瘤细胞具有促凋亡作用，并且目前认为RA关节软骨和骨组织的损害主要是由于滑膜细胞的活化和增生引起。RA滑膜组织表现为增生性侵蚀性生长，类似于肿瘤细胞的生长及病理学行为特性。因此，推测丹参可能通过促滑膜细胞凋亡而抑制RA滑膜细胞生长。
本实验通过丹参作用于RA FLSs，光学显微镜下观察到细胞形态、数量均发生明显改变，经AnnexinV/PI双染法结合FCM检测发现这种改变主要是丹参诱导RA FLSs凋亡增加引起的。我们先前证实当丹参浓度达到50mg/mL时RA FLSs培养上清液TNF-α表达较对照组显著降低[8]。已知TNF-α不仅是坏死的刺激因子，同时也参与了凋亡途径。研究显示，TNF-α启动caspase凋亡途径，促进细胞的凋亡[9]。我们实验结果也表明，当丹参浓度达到50mg/mL时，其凋亡率比丹参浓度为0.39mg/mL(此丹参浓度环境下，RA FLSs培养上清液TNF-α表达较溶剂对照组未发生明显改变[8])时的凋亡率有显著增加(P<0.05)。此外，实验结果显示，低剂量丹参组比对照组的凋亡率有显著增加，而我们先前的研究证实，此时TNF-α的表达没有明显改变，说明可能有其他途径参与丹参促RA FLSs的凋亡，同时也表明丹参促RA FLSs凋亡具有剂量效应。虽然本研究表明TNF-α可能参与了丹参诱导RA FLSs凋亡过程，但也表明丹参诱导RA FLSs凋亡机制的复杂性，这均有待于进一步的研究。
参考文献
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