作者：孙丽丽，焦谊，关亚群，王延蛟，刘晓宇，张成
【摘要】 目的通过对维吾尔族肥胖患者及3T3-L1脂肪细胞内脂素mRNA表达的检测，探讨内脂素mRNA表达与肥胖之间的关系。方法根据体重指数(BMI)将116名研究对象分为肥胖组和非肥胖组。①测量研究对象的体征指标和代谢参数，计算BMI和腰臀围比(WHR);②采用3-异丁基-1甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松联合方案诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;③应用RT-PCR方法检测受试者皮下和网膜脂肪组织以及3T3-L1前脂肪细胞在不同分化时段内脂素mRNA的表达水平。结果①肥胖组皮下脂肪组织内脂素的表达较非肥胖组显著升高(P=0.048)，网膜脂肪组织内脂素的表达水平较非肥胖组有升高趋势，但差异无统计学意义。②相关性分析显示，网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达量与BMI(r=0.26，P=0.047)、甘油三脂(TG)(r=0.298，P=0.000)和腰围呈正相关(r=0.191，P=0.041);皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量与TG呈显著正相关(r=0.384，P=0.000)。③在3T3-L1前脂肪细胞的分化过程中内脂素mRNA表达水平逐渐升高，至分化末期达到较高水平且趋于稳定。其中，诱导分化后第6～12天较分化第0天显著升高(P<0.05)，诱导分化第10～12天较第2～6天显著升高，诱导分化第12天较第6～8天显著升高。结论内脂素可能与维吾尔族肥胖及脂代谢有关;体外实验证实内脂素与肥胖的发生、发展有密切的关系。
【关键词】 内脂素;肥胖;3T3-L1前脂肪细胞;逆转录-聚合酶链反应
ABSTRACT: ObjectiveTo explore the expression of visfatin mRNA in 3T3-L1 adipocytes in Uygur obese population and its association with obesity. MethodsTotally 116 subjects were pided into obesity group and non-obesity group according to body mass index (BMI). ① Measurement of anthropometric and metabolic parameters in the Uygur subjects and calculation of their BMI and wrist-hip ratio (WHR). ② The differentiation of 3T3-L1 pre-adipocyte was induced by incubating the cells with 3-isobutyl-1-methylxanthine， insulin and dexamethasane. ③ RT-PCR was used to detect the expression of visfatin mRNA from subcutaneous， omental adipose tissues and mature 3T3-L1 adipocyte.Results① The expression of visfatin mRNA in subcutaneous adipose tissues in the obese group was significantly higher than that in the control one (P=0.048). ② Correlation analysis showed that the expression of visfatin mRNA in omental adipose tissues was correlated with BMI (r=0.26， P=0.047)， TG(r=0.298， P=0.000) and waist circumference (r=0.191， P=0.041). Visfatin mRNA expression in subcutaneous tissues was positively correlated with TG (r=0.384， P=0.000). ③During the differentiation phase of 3T3-L1 adipocytes， the expression of visfatin mRNA was increased， and the mRNA expression of visfatin gene remained a higher level and unchanged in the telophase. The expression level of visfatin mRNA from day 6 to 12 was higher than day 0 (P<0.05); from day 10 to 12 the expression of visfatin was higher than from day 0 to 6; the twelfth-day xpression of visfatin was higher than from that from day 6 to 8.ConclusionVisfatin may be related to the development of obesity and lipid metabolism in Uygur population. Visfatin may have a close association with the occurrence and development of obesity.
KEY WORDS: visfatin; obesity; 3T3-L1 preadipocyte; reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
近年来，随着我国人民生活水平的提高，肥胖人口的比例不断上升。有研究表明，肥胖不仅是导致心脑血管疾病的高危因素，而且可增加糖尿病、高脂血症及代谢综合征等疾病的发病率[1]。肥胖症并非单基因突变导致的遗传性疾病，现已发现多种脂肪细胞因子与肥胖症的发生相关。新发现的内脂素(visfatin)具有促进脂质形成和拟胰岛素活性作用。以前我们以新疆维吾尔族肥胖患者为研究对象，探讨了内脂素的表达及其与血糖、血脂等因素的关系，为进一步研究该基因与肥胖之间的关系，本研究亦选取肥胖症患病率较高的新疆维吾尔族为受试人群[2]，并以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，观察内脂素基因在人的脂肪组织和前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中表达水平的变化，探讨该基因与脂肪细胞分化、肥胖的发生及肥胖相关疾病的关系。
1资料与方法
1.1研究对象选取就诊于新疆维吾尔自治区人民医院胆结石择期手术患者，排除急性炎症期、肿瘤及其他内分泌疾病和各种传染性疾病，共116例。根据2000年亚太地区成人肥胖分类标准(BMI≥25kg/m2为肥胖切入点)，将其分为肥胖组(79例，男38例，女41例)和非肥胖组(37例，男16例，女21例)。本研究已通过伦理委员会审核，所有研究对象均签署了知情同意书。
1.2方法
1.2.1临床资料和标本的收集专人测量研究对象的身高、体重、腰围、臀围和血压，计算体重指数(BMI)和腰臀围比(WHR)。手术当日患者空腹(禁食8～12h)采集肘静脉血，检测空腹血糖(FBG)、胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。在手术过程中取皮下和网膜脂肪组织各约200mg，去除肉眼可见的血管和血块，迅速放入液氮中冷冻，标本统一放入-80℃低温冰箱中保存。
1.2.23T3-L1前脂肪细胞的诱导分化根据3T3-L1细胞培养和诱导分化方案[3]，用完全培养基(DMEM+100mL/L胎牛血清+青霉素100u/mL+链霉素100μg/mL)在37℃孵箱(50mL/L CO2)中培养，每两天换液1次。待细胞长至完全融合后2d(第0天)，开始换诱导液Ⅰ(含有0.5mmol/L IBMX+2.5μmol/L地塞米松+5μg/mL胰岛素的完全培养基)诱导分化48h，诱导液Ⅱ(含有5μg/mL胰岛素的完全培养基)诱导分化48h，完全培养基继续培养，每两天换液1次，至第12天90%的细胞已分化为成熟的脂肪细胞。在细胞诱导分化的第2、4、6、8、10、12天分别收集细胞，存放于-70℃低温冰箱中保存。
1.2.3油红O染色鉴定配置30g/L的油红O染料为储存液，使用时将其以6∶4的比例与蒸馏水混合为工作液，分别取第0、2、4、6、8、10、12天的细胞，先用PBS洗3遍，100mL/L的甲醛溶液固定20min，蒸馏水冲洗干净，油红O染色1h，酒精分色20s，蒸馏水冲洗至背景透明。苏木精染色1min，蒸馏水冲洗干净至背景透明。显微镜下观察，可见胞质中脂滴呈亮红色，核仁蓝染。
1.2.4脂肪组织和脂肪细胞总RNA的提取 用经典Trizol法提取脂肪组织和3T3-L1脂肪细胞的总RNA，应用Gene Quant核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
1.2.5内脂素基因mRNA表达的检测引物设计与合成：应用primer 5.0设计人和小鼠的内脂素与内参照β-actin的引物，由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。表1RT-PCR引物序列cDNA链的合成：取总RNA 1μg，参照Promega试剂盒说明书，逆转录合成单链cDNA。 聚合酶链反应(PCR)合成第2条链：产物cDNA直接作模板扩增人和小鼠的内脂素和β-actin基因。人β-actin扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃总延伸7min。人内脂素的扩增采用touch-down PCR，55℃退火30s，经过16个循环，其中每两个循环降0.5℃，51℃退火30s，经过14个循环，其他条件与β-actin的扩增条件一致。3T3-L1前脂肪细胞的内脂素与β-actin的扩增条件一致为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃总延伸7min。扩增完毕后取扩增产物5μL，于20g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，紫外灯下观察结果，并在凝胶成像仪上成像。采用Bio-Rad Quantity One图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的吸光度(A)值，以β-actin的A值作为内参照，计算人和3T3-L1前脂肪细胞内脂素基因的相对表达量并进行半定量分析。
1.2.6相关生化指标测定采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖，酶化学法测定TC、TG、HDL-C、LDL-C的浓度。
1.3统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计学处理。所有计量资料均用±s表示，符合正态分布的资料，组内比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，非正态分布资料行对数转换后再进行统计分析，内脂素与各指标间的关系研究用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1临床和实验室生化资料的比较两组间体重、腰围、臀围、WHR、BMI、SBP比较，差异有统计学意义(P<0.05);年龄、空腹血糖、DBP、TG、TC、HDL-C、LDL-C两组之间比较，差异无统计学意义(表2)。表2两组间临床与实验室生化资料的比较
2.2皮下和网膜脂肪组织中内脂素基因表达量的比较肥胖组皮下脂肪组织中内脂素表达较非肥胖组显著升高(P=0.048)，网膜脂肪组织内脂素表达水平较非肥胖组虽有升高趋势，但差异无统计学意义。两组的网膜脂肪组织与皮下脂肪组织内脂素的表达水平无差异(表3、图1)。表3两组皮下和网膜脂肪组织中内脂素mRNA表达水平的分析
2.3皮下和网膜脂肪组织中内脂素mRNA的表达与各因素间的相关性分析网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量与BMI(r=0.26，P=0.047)、TG(r=0.298， P=0.000)和腰围(r=0.191，P=0.041)呈正相关;皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量与TG显著正相关(r=0.384，P=0.000)。
2.43T3-L1前脂肪细胞诱导分化不同时间点内脂素mRNA的表达3T3-L1前脂肪细胞诱导分化前呈梭形，胞质内未见亮红色脂滴。待细胞生长至完全融合后2d(第0天)开始诱导分化，第2天到第4天图1人脂肪组织RT-PCR产物的25g/L琼脂糖凝胶电泳Fig.125g/L agrose gel electrophoresis of RT-PCR product1～2、3～4泳道分别为肥胖组的皮下和网膜的内脂素和β-actin表达;5～6、7～8泳道分别为非肥胖组的皮下和网膜的内脂素和β-actin表达;9：DNA Marker。细胞形态发生明显变化，细胞体积增大，逐渐由梭形变成为圆形，油红O染色可见少数细胞的胞质内开始出现亮红的脂滴;第6天时，可见50%以上的细胞已分化成熟;第12天时，含有亮红色脂滴的成熟脂肪细胞在视野中占90%以上，且细胞体积大、形态圆(图2)。在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中内脂素mRNA表达水平逐渐升高，至分化末期达到较高水平且趋于稳定。其中，诱导分化后第6～12天较分化第0天显著升高(P<0.05)，诱导分化第10～12天较第2～6天显著升高，诱导分化第12天较第6～8天显著升高(表4、图3)。图23T3-L1前脂肪细胞在诱导分化的不同时间点的油红O染色结果Fig.2 Oil red O staining during different time points of differentiation of 3T3-L1 preadipocytes (×200)A：诱导分化前;B：诱导分化第2天;C：诱导分化第6天;D：诱导分化第8天;E：诱导分化第10天;F：诱导分化第12天。表43T3-L1前脂肪细胞诱导分化不同时段内脂素mRNA表达水平的分析图33T3-L1前脂肪细胞诱导分化不同时段内脂素mRNA的表达变化Fig.3 Expression of visfatin mRNA during different time points of differentiation of 3T3-L1 adipocytes1～7：分别为诱导分化第0、2、4、6、8、10、12天内脂素和β-actin mRNA的表达;8：DNA Marker。
3讨论
脂肪组织不仅是能量的储存器官，还是一个重要的内分泌器官，能够分泌多种脂肪细胞因子，如瘦素、抵抗素、脂联素和内脂素等。内脂素(visfatin)是2005年日本学者FUKUHARA等[4]采用差异显示方法，比较两位女性内脏脂肪和皮下脂肪标本的8800对PCR产物发现的一种在内脏脂肪中高表达的脂肪细胞因子。该因子能够调控腹部脂肪细胞的分化和脂质的合成，并能与胰岛素受体结合，调节胰岛素的敏感性。BERNDT[5]在对高加索人的研究发现，内脂素基因表达在内脏和皮下脂肪组织之间没有统计学上的差异;而VARMA等[6]发现，正常对照组皮下脂肪组织中内脂素mRNA的表达水平较网膜脂肪组织升高。JIAN[7]对中国汉族人的研究发现，血浆内脂素浓度在肥胖组低于超重和正常对照组，在超重和正常对照组之间无明显差异，内脂素水平在男性和女性组与BMI、WHR以及血糖、胰岛素敏感性指标均无相关性。本研究发现，新疆维吾尔族肥胖患者的皮下内脂素mRNA的表达显著高于非肥胖对照组;与非肥胖组相比，肥胖组的皮下和网膜脂肪组织内脂素mRNA表达虽无统计学差异，但均有升高趋势。提示，内脂素在肥胖的发生发展和脂质积聚的过程中起着重要的作用。本实验结果与其他研究结果存在差异，可能是所选择的研究对象的不同，这也提示内脂素的表达可能存在种族或者民族差异。
相关性分析显示，网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量与BMI呈显著正相关，与DANIEL等[8]的研究结果相似，提示内脂素与肥胖程度有密切关系，即肥胖程度越重，体脂含量越高，内脂素基因表达水平越高。网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达量与腰围呈正相关，提示内脂素与体脂分布密切相关;腹型肥胖是诊断代谢综合征的必要因素，内脂素可能亦与代谢综合征的发病机制有关;皮下和网膜脂肪组织内脂素mRNA表达与TG均呈正相关，提示内脂素可能与甘油三酯代谢有关。
本研究以体外培养的3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，观察了内脂素在脂肪细胞诱导分化过程中的变化趋势。结果发现，内脂素基因在成熟的3T3-L1脂肪细胞中表达，并且随细胞分化成熟、胞内脂质的不断积聚其表达水平有逐渐升高的趋势，至脂肪细胞完全分化成熟，内脂素基因保持在较高水平。其机制可能是：内脂素具有拟胰岛素活性，结合并活化与胰岛素受体，活化信号转导通路，促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取，促进培养基中葡萄糖转化为甘油三酯，促进甘油三酯在前脂肪细胞的聚集。提示内脂素在脂肪的堆积和脂质形成中起到了一定的作用，可能与肥胖症的发病机制有关。
总之，内脂素的研究尚处于起始阶段，各研究小组的结论有所差异。本研究发现，内脂素可能与维吾尔族肥胖及脂代谢有关，体外实验亦证实内脂素与肥胖的发生发展有密切的关系。
参考文献
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