【摘要】 目的探讨临床I期(cI期)非小细胞肺癌(NSCLC)中血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达、微淋巴管密度(MLVD)、淋巴结转移及其与化疗的关系。方法应用免疫组化SP法检测cI期NSCLC癌组织、癌旁组织及正常肺组织中VEGF-C的表达，计数MLVD，检测血清VEGF-C蛋白含量，并结合病理淋巴结转移情况和化疗前、后VEGF-C蛋白含量的变化进行统计学分析。结果在NSCLC中，VEGF-C呈过度表达，与癌旁组织和正常肺组织相比差异有统计学意义(P<0.01);在癌组织中淋巴结阳性组和淋巴结阴性组的VEGF-C阳性表达率(91.9% vs. 76.7%)、MLVD\[(20.0±4.8) vs. (10.6±2.2)\]差异有统计学意义(P<0.01);血清VEGF-C蛋白含量与组织检测VEGF-C具有较好的相关性(r=0.848， P<0.01)，化疗患者化疗前血清VEGF-C蛋白含量(237±72.3)ng/mL较化疗后(178±69.2)ng/mL变化明显(P<0.01)。结论VEGF-C在cI期NSCLC中过度表达与淋巴结转移密切相关;血清VEGF-C蛋白含量测定是一种有效的VEGF-C检测方法;化疗前、后血清VEGF-C蛋白含量的变化可以预测化疗效果。
【关键词】 非小细胞肺癌;血管内皮生长因子;微淋巴管密度;淋巴结转移
ABSTRACT: ObjectiveTo study the correlation of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression and lymphatic microvessel density (MLVD) with lymphatic metastasis and sensitivity of chemotherapy in non-small cell lung cancer (NSCLC) of clinical stage Ⅰ.MethodsVEGF-C expression and MLVD were detected in cancer tissues， para-cancer tissues of clinical stage I NSCLC and normal lung tissues. The clinico-pathological results of lymphatic metastasis and VEGF-C protein changes after chemotherapy were analyzed statistically.ResultsIn cancer tissues of NSCLC， the over-expression of VEGF-C was significantly higher than that in para-cancer tissues and normal lung tissues (P<0.01). The positive rates of VEGF-C expression (91.9% vs. 76.7%) and MLVD [(20.0±4.8)vs. (10.6±2.2)] in lymphatic metastasis group were significantly higher than those in groups without lymphatic metastasis (P<0.01). The detection of VEGF-C in serum had a close correlation with VEGF-C protein in tissues (r=0.848， P<0.01). The level of VEGF-C protein in serum before chemotherapy (237±72.3)ng/mL was significantly reduced after chemotherapy[(178±69.2)ng/mL， P<0.01)].ConclusionOver-expression of VEGF-C is closely related to lymphatic metastasis in NSCLC of clinical stage Ⅰ. The detection of VEGF-C in serum is helpful in clinical stage; changes of VEGF-C protein in serum before and after chemotherapy can predict the results of chemotherapy.
KEY WORDS: non-small cell lung cancer (NSCLC); vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C); lymphatic microvessel density; lymphatic metastasis
肺癌的发病率在逐年增高，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)是其主要类型，淋巴结转移是影响NSCLC的主要因素之一。本研究通过检测67例临床Ⅰ期(cⅠ期)NSCLC患者的癌组织、癌旁组织和20例正常肺组织中的血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C， VEGF-C)表达，计数微淋巴管密度(MLVD)，探讨其与淋巴结转移的关系;检测相关血清VEGF-C的蛋白含量，分析血清VEGF-C检测的意义，并通过化疗前、后血清VEGF-C的变化推测化疗的敏感性。
1材料与方法
1.1研究对象选取青岛大学医学院附属医院胸外科2008年1月～2008年7月间的全部手术患者。入组条件为：手术前没有施行放疗和化疗;术前临床分期(结合强化CT、PET-CT、纵隔镜检查等)为cⅠ期;手术施行了根治性肺叶切除、系统性淋巴结清扫;随访资料确实;术后常规病理确诊为NSCLC的患者。共67例患者入组。手术中取标本癌组织、癌旁肺组织(为距肿块边缘3cm以上肺组织)，以同期20例行良性肿瘤肺叶切除术患者的正常肺组织作为对照。淋巴结清扫范围参考MD-ATSmap[1]肺癌区域淋巴结图谱。37例术后病理有淋巴结转移患者，在术后行顺铂与长春瑞宾两药联合标准化疗方案治疗。采取全部患者术前、化疗患者化疗前和化疗后(即第3周期化疗前)空腹血5mL，离心保留血清，置于-70℃冰箱保存。
1.2试剂和设备克隆抗体VEGF-C、单克隆抗体D2-40购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;BIO-TEK ELX808酶标仪等。
1.3标本处理方法术中取新鲜标本组织，直径约为0.5cm，常规石蜡固定，4μm连续切片，取中间3张，1张行HE染色，1张行VEGF-C免疫组化染色，1张行D2-40染色。ELISA操作按照试剂盒说明进行，检测波长为450nm，全部标本双管检测，取平均值，差距超过50pg/L时重新操作。
1.4结果判定结果由3位病理科医师独立单盲阅片，结果差距超过30%者，交换阅片，取其平均值。VEGF-C和D2-40的阳性免疫产物是位于细胞质内的棕黄色颗粒。①VEGF-C：基本不着色为0分，着淡黄色为1分，着色适中为2分，着色深黄为3分;着色细胞占总细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将每张切片的着色程度得分和着色细胞数得分相乘为最后得分：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性()，6～9分为强阳性()。②D2-40：凡染成棕黄色颗粒状，管壁由单层内皮细胞构成，内没有红细胞的确认为淋巴管。在×40倍镜下选取3个不同染色密集区域，×200镜下视野内计数淋巴管总数作为MLVD。
1.5统计学处理应用SPSS10.0软件对数据进行统计分析。不同组间表达强度的比较采用秩和检验，两组间计量资料的比较采用t检验，多组间计量资料的比较采用方差分析，样本率的比较采用卡方检验。检验水准为0.05。
2结果
2.1不同组织标本中VEGF-C的表达及其与MLVD的关系癌组织、癌旁组织和正常肺组织中VEGF-C均有表达，其阳性率分别为85.1%、23.9%和15.0%，差异具有统计学意义(P<0.01);不同组织标本中VEGF-C的表达强度比较差异亦有统计学意义(Hc=96.4235，P<0.01)。不同组织标本中均有D2-40染色的微淋巴管，但是MLVD在不同组间比较差异有统计学意义(F=82.8566，P<0.01)，其中癌组织中的MLVD明显高于癌旁组织和正常组织(q=17.1066、10.9014，P<0.01，表1)。相关性分析显示，癌组织VEGF-C表达强度与MLVD具有相关性(r=0.831， P<0.01)。表1不同组织标本中VEGF-C的表达及MLVD值
2.2NSCLC癌组织中VEGF-C表达、MLVD和淋巴结转移的关系淋巴结阳性组VEGF-C的阳性率及强阳性率与淋巴结阴性组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。淋巴结阳性组的MLVD与淋巴结阴性组比较差异亦有统计学意义(P<0.01，表2)。表2NSCLC癌组织中VEGF-C表达、MLVD和淋巴结转移的关系
2.3血清VEGF-C蛋白的含量ELSIA血清VEGF-C检测的阳性率(83.7%)与组织SP法检测的阳性率(85.1%)差异无统计学意义(P>0.05)。在淋巴结阳性组中VEGF-C的含量(207±62.3)较淋巴结阴性组(162±42.7)明显增高(P<0.01);在癌组织中VEGF-C强阳性的患者术前血清VEGF-C蛋白含量(261±82.1)明显高于阴性的患者(147±47.3)。直线相关分析显示，血清VEGF-C蛋白含量相对于癌组织检测的VEGF-C具有显著相关性(r=0.848， P<0.01)。化疗患者化疗前血清VEGF-C蛋白含量(237±72.3)ng/mL较化疗后(178±69.2)ng/mL变化明显(P<0.01)。
3讨论
区域性淋巴结转移是NSCLC的重要转移途径，而淋巴结转移与否及转移程度是影响NSCLC病理分期[2]和预后的主要因素之一。淋巴管生成是肿瘤发生淋巴结转移的步骤与先决条件，早发现、早诊断、早期抑制及干预淋巴转移是改善NSCLC治疗效果的理想途径。D2-40是新发现的特异性淋巴管内皮标记物，具有较好的敏感性和特异性[3]。TAKANAMI[4]研究认为，以D2-40标记的MLVD是淋巴结转移的独立预测因子。
VEGF-C主要作用是促进淋巴管新生，调节肿瘤血管新生和淋巴管生成，促进肿瘤细胞进入淋巴管，并通过淋巴系统向全身转移和扩散[5]。现已明确，肿瘤细胞可以通过表达淋巴管生成的调控因子VEGF-C 诱导淋巴管生成，人工诱导淋巴管生成能促进肿瘤淋巴结转移[6]。HE等[7]研究表明，VEGF-C可使淋巴内皮在肿瘤细胞密集区内大量增生，并促进淋巴管扩张，且新生的微淋巴管结构并不完善，处于高渗漏状态，有利于肿瘤细胞进入淋巴管发生转移。刘杏娥[8]等报道VEGF-C蛋白阳性表达率随着NSCLC淋巴结转移程度上升而升高;张惠忠等[9]研究证实VEGF-C蛋白高表达提示肺癌患者容易出现淋巴结转移和预后不良，指出VEGF-C是非小细胞肺癌一个重要的预后因子。
本研究选择临床I期患者，病例数较多，能更好的说明研究目的。本研究结果证实，VEGF-C在癌组织中过度表达，淋巴结阳性组VEGF-C表达明显高于淋巴结阴性组，提示肿瘤的淋巴转移和浸润可能与VEGF-C过度表达有关。VEGF-C的过度表达与MLVD呈显著性相关。相比正常肺组织，癌旁组织中VEGF-C表达增强较MLVD更明显，VEGF-C过度表达、MLVD与淋巴结转移关系密切。推测VEGF-C 在NSCLC 癌细胞中过度表达，诱导肺癌微淋巴管生成，为癌细胞向淋巴管转移提供了条件，从而促进肺癌淋巴结转移。血清ELSIA法检测蛋白含量是一种临床广泛应用的一种简单、有效的检测方法。结果显示，血清ELSIA法检测血清VEGF-C蛋白含量与癌组织VEGF-C检测一致性好，有明确相关性。化疗前、后血清VEGF-C含量比较结果显示，血清VEGF-C蛋白含量变化可以作为非小细胞肺癌患者化疗效果评价的指标。对于VEGF-C过度表达的cI期NSCLC患者，区域淋巴结清扫中淋巴结阳性率更高，清扫的意义更强，发生淋巴结转移的时间更早，预后也就较差。强化术中淋巴结系统清扫和术后进行早期辅助化疗治疗，可能获得更好的治疗效果。血清VEGF-C蛋白含量定量检测有利于指导术前NSCLC临床分期，评价手术效果，指导患者术后化疗并评价化疗效果，预测非小细胞肺癌患者手术治疗后肿瘤的复发和转移。由于研究时间尚短，cI期NSCLC患者手术效果和化疗效果，还没有长期的随访数据，尚不能提供更好的证据证明该项研究的确实意义，以推广临床的应用。但是，我们已经对相关的病例进行随访，开始了相关的前瞻性研究。
综上所述，VEGF-C在cⅠ期NSCLC中过度表达与淋巴结转移密切相关;血清VEGF-C蛋白测定是一种可行、可靠的VEGF-C检测方法，可以指导术前肿瘤分期及手术中淋巴结清扫，提示术后化疗和评估化疗效果。本研究为肺癌抗淋巴管生成治疗，抑制淋巴途径转移药物和靶向药物的研究提供理论依据。