凋亡抑制基因Survivin和GW112在Barrett食管与食管腺癌中的表达及其意义

　　　　 作者：赵俊杰，雷艳霞，任春蓉，赵晶，刘晓庆

【摘要】 目的探讨凋亡抑制基因Survivin和GW112在反流性食管炎、Barrett食管及食管腺癌中的表达及其意义。方法采用SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法检测反流性食管炎、Barrett食管、食管腺癌黏膜组织中Survivin mRNA和GW112 mRNA的表达。结果GW112在对照组和反流性食管炎阴性组中呈低水平表达，明显低于反流性食管炎阳性组、Barrett食管组及食管腺癌组的表达(P<0.05)，反流性食管炎阳性组、Barrett食管组及食管腺癌组GW112表达水平无明显差异(P>0.05)。Survivin表达水平依正常对照、反流性食管炎阴性、反流性食管炎阳性、Barrett食管、食管腺癌的次序渐进增强，其中反流性食管炎阳性组、Barrett食管与食管腺癌组患者Survivin表达水平明显高于对照组和反流性食管炎阴性组(P<0.05，P<0.01)，且3组间亦存在显著性差异(P<0.05，P<0.01)。结论Survivin和GW112基因的过度表达引起的细胞凋亡抑制在Barrett食管及其腺癌发生、发展过程中起着重要的作用，尤其是Survivin在Barrett食管与食管腺癌的发生、发展最早步骤中可能扮演着更主要的角色。

【关键词】 Survivin;GW112;Barrett食管;食管腺癌;实时荧光定量PCR

　ABSTRACT: ObjectiveTo explore the expression and significance of survivin and GW112 in development of reflux esophagitis， Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma.MethodsThe expression levels of survivin and GW112 in mucosa tissues of patients with reflux esophagitis， Barretts esophagus or esophageal adenocarcinoma were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsThe expression of GW112 mRNA in the Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma tissues was significantly higher than that in the normal and reflux esophagitis-negative esophageal tissues (P<0.05)， but it did not significantly differ between Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma. The expression of survivin mRNA was significantly higher in Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma tissues than in the normal and reflux esophagitis esophageal tissues (P<0.05， P<0.01); moreover， it increased progressively with the development order of reflux esophagitis， Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma， and was related to staging.　ConclusionThe overexpression of survivin and GW11 in Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma suggests that survivin and GW112 gene may play an important role in the genesis and progression of Barretts esophagus and esophageal adenocarcinoma.

　　KEY WORDS: survivin; GW112; Barretts esophagus; esophageal adenocarcinoma; real-time quantitative PCR

　　Barrett食管(Barretts esophagus， BE)与食管腺癌(esophageal adenocarcinoma， EA)的发生密切相关。近年来二者的发生率逐渐升高。关于BE及EA发生的确切机制目前尚不清楚。现代分子生物学研究显示BE与EA的发生、发展不仅存在细胞的增殖和分化的异常，同时也存在细胞凋亡异常。Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子。GW112是近年来发现的一种新的抗凋亡基因，广泛表达于人类的多种肿瘤尤其是消化系统肿瘤中，其表达与肿瘤的恶性程度及侵袭转移密切相关。

　　目前，虽有一些关于Survivin与BE及EA的研究报道，但多为免疫组化、半定量逆转录PCR技术的结果[1-2]，而GW112与BE及EA的研究尚未见报道。为此，本研究采用实时定量PCR(RT-PCR)检测抗细胞凋亡基因Survivin和GW112 mRNA在BE及EA黏膜组织中的表达，探讨其在食管腺癌发生、发展中的作用以及在食管癌的诊断、治疗以及预后判断等方面的意义。

　　1对象与方法

　　1.1对象选取2008年4月～2008年10月在西安交通大学医学院第二附属医院就诊及住院的患者56例，其中男31例，女25例，年龄31～75(平均49.7)岁。所有患者均在胃镜下取食道黏膜标本2块，其中1份做病理检查，另1份液氮迅速冷冻1h，然后转入-80℃冰箱保存备用。病例筛选依据胃镜检查及病理诊断结果，并结合临床症状最后确定，其中：正常对照7例;反流性食管炎阴性14例;反流性食管炎阳性15例;BE 10例;EA 10例。

　　1.2RNA的提取应用Invitrogen公司Trizol试剂盒，按说明书要求提取RNA，并用Nano Drop ND-1000分光光度计测定含量和纯度。所提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，-80℃保存待用。

　　1.3cDNA的合成采用Lifeson Medical Tech Co， Ltd逆转录试剂盒，在PCR反应管中加入2μg总RNA，1μg Random Primer，加入RNase free水，使终体积为15μL。70℃孵育10min冰上迅速冷却。然后冰上加入10×RT Buffer 2.5μL，dNTP Mix(12.5mmol/L)2.0μL，RNase Inhibitor(40Units/μL)0.6μL，RT Enzyme 5u/μg mRNA，加DEPC水，使终体积为25μL。逆转录条件为：42℃，50min，95℃，3min。

　　1.4实时荧光定量PCR

　　1.4.1引物设计及合成以NCBI GenBank中提供的人类基因序列行引物设计，由北京奥科生物技术有限责任公司合成(表1)，以管家基因β-actin作为内参基因。表1引物序列

　　1.4.2荧光定量PCR采用Lifeson Medical Tech Co，Ltd Two-Step RT-PCR试剂盒，在25μL反应体系中加入Real Time PCR Master Mix(2×)12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，cDNA 1μL，Green DNA Ⅰdye(5×)3μL，用DEPC水将总反应体积调至25μL。置于ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪中按下述反应条件进行扩增。反应条件为：95℃ 15min，然后95℃ 30s，59℃ 1min(GW112此温度为58.5℃)，72℃ 30s共40循环。

　　1.4.3标准曲线制作及融解曲线分析参考LANGMANN等[3]方法，用经逆转录所获得的cDNA作为标准品，经系列稀释后(1～10-5)，与被检样本同时扩增，制备目的基因和内参基因的标准曲线。用目的基因的定量结果除以内参基因的定量结果得到校正值，用此校正值进行组间比较分析。PCR反应结束后，将PCR反应液温度自60℃至95℃缓慢升温，实时监测SYBR GreenⅠ的荧光信号强度变化，获取融解曲线，以确认PCR反应的特异性，理想的融解曲线应为单一峰型曲线。

　　1.5统计学分析用目的基因与内参基因相对表达量的比值作为组织中Survivin和GW112表达水平的指标，以NT/反应的平均值±标准差　　(±s)表示。实验数据输入SPSS11.0，组间差异采用方差分析检验，以P<0.05为有显著性差异。

　　2结果

　　2.1琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的结果提取的总RNA行12g/L琼脂糖凝胶电泳，可见明显的28S、18S两条区带，并且28S的亮度约是18S的2倍，说明RNA完整，无降解(图1)。

　　2.2融解曲线分析结果采用SYBR GreenⅠ荧光嵌合法检测时，须通过融解曲线分析，确认PCR反应的特异性。本实验结果显示各PCR产物的融解曲线呈单一锐利峰型(图2、图3)，说明PCR扩增属特异性扩增，所获结果可靠。图1RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 RNA electrophoresis pictureM：DNA Marker; 1、2：对照;3、4：反流性食管炎阳性组;5、6：食管组;7、8：食管腺癌。

　　2.3Survivin与GW112 mRNA在各病例组黏膜组织中的表达参考LANGMANN[3]方法，进行PCR

　　分析和标准曲线制作，Survivin、GW112和β-actin的Ct值与拷贝数之间呈良好线性关系，相关系数r分别为0.998、0.996、0.994，曲线斜率分别为-0.489、-0.479、-0.515。数据分析结果显示，对照组与反流性食管炎阴性组GW112 mRNA的表达呈低水平，明显低于反流性食管炎阳性组、Barrett食管组和食管腺癌组(P<0.05)，Barrett食管和食管腺癌组间未见明显差异(P>0.05，表2)。Survivin mRNA表达水平依正常对照、反流性食管炎阴性、反流性食管炎阳性、BE、EA的次序呈渐进性增强。反流性食管炎阳性组、BE与EA组患者Survivin mRNA表达水平明显高于对照组和反流性食管炎阴性组(P<0.05，P<0.01)，且3组间亦存在显著性差异(P<0.05，P<0.01)，EA组患者Survivin mRNA表达水平最高(图4、表2)。图2Survivin、β-actin融解曲线图3GW112融解曲线图4Survivin扩增曲线Fig.2 Dissociation curve of survivinFig.3 Dissociation curve of GW112Fig.4 Amplification curve survivin and β-actin表2食管黏膜组织中Survivin与GW112 mRNA的表达

　　3讨论

　　GW112是近年来发现的抗细胞凋亡基因，其蛋白产物为Olfactomedin4的前体，属于Olfactomedin相关蛋白家族。可表达在人类的多种肿瘤尤其是消化系统肿瘤中，其表达与肿瘤的恶性程度及侵袭转移密切相关[4]。体外实验研究发现GW112蛋白和具有诱导细胞凋亡功能的蛋白GRIM 19结合，消弱retinoicacid/IFN β通路的诱导细胞凋亡的作用，从而抑制细胞凋亡，令肿瘤细胞恶性生长[5]。随后有作者分别采用表达串联分析、芯片杂交、实时荧光定量RT-PCR的方法证实了GW112基因在胃癌组织中高表达[6-7]。但GW112与BE及EA有关的研究目前未见报道。本研究采用实时荧光定量RT-PCR的方法分析了反流性食管炎阴性、反流性食管炎阳性、BE与EA组患者食管黏膜中GW112 mRNA的表达水平，结果显示，GW112 mRNA在对照组与反流性食管炎阴性组中呈低水平表达，在反流性食管炎阳性组、BE组和EA组中呈高水平表达，而在BE和EA组间未见明显差异，提示GW112 mRNA表达水平升高可能是BE与EA的早期事件。

　　Survivin作为迄今发现最强的凋亡抑制因子，广泛表达于各种人类肿瘤，并与肿瘤生物学特性有关，随着分化程度的降低、临床分期的增高及淋巴结的转移，Survivin的表达逐渐增强[8]。Survivin在食管癌中的研究报道多为对食管鳞癌中Survivin表达的研究，BE以及进展到EA过程中Survivin表达研究较少。PARENTI等[9]应用免疫组化研究Survivin在BE胞浆中的表达结果提示Survivin过表达是BE增生过程中的一个早期事件，并且在BE病变过程早期，抗凋亡作用占主要地位。VALLBOHMER等[10]利用逆转录PCR技术测定BE化生-异型增生-腺癌演变过程中Survivin

　　mRNA的表达情况，由高到低依次是：异型增生上皮组织>腺癌组织>对照组正常胃窦柱状上皮>Barrett化生上皮>正常鳞状上皮。由此认为Survivin是Barrett食管腺癌发生的一个潜在的生物标记物，能区分静止的BE上皮、异型增生的Barrett上皮和Barrett食管腺癌。本研究采用实时荧光定量PCR方法对反流性食管炎阳性、BE、EA患者食管黏膜组织中Survivin mRNA的表达水平进行了检测，结果显示Survivin表达水平依正常对照、反流性食管炎阴性黏膜、反流性食管炎阳性、Barrett食管、食管腺癌的次序渐进增强，提示Survivin的表达贯穿于反流性食管炎、Barrett食管、食管腺癌发生、发展的始终，说明survivin过表达是BE增生过程中的一个早期事件。反流性食管炎、BE、EA患者间Survivin mRNA表达水平的明显差异提示通过定量PCR检测Survivin表达水平对Barrett食管与食管腺癌的早期诊断、预后判断有一定价值。

　　综上所述，在BE与EA发生、发展过程中，凋亡抑制基因GW112与Survivin协同过度表达使细胞凋亡减少，增生增加，细胞增生与凋亡平衡被打破，从而在食管癌的发生和发展中起到重要作用;尤其是Survivin作为肿瘤发生、发展的枢纽基因，不仅在食管腺癌中表达，而且在BE与EA的发生、发展过程中，随着癌前细胞向癌细胞的转化，Survivin的表达呈渐进性升高。提示Survivin在BE与EA的发生、发展最早步骤中扮演更主要角色。

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