作者：魏峰，张静，韩克，刘昱，王亭忠，倪雅娟，马爱群
【摘要】 目的在非人工通气条件下，以较小的创伤且简单、快速地建立大鼠急性心肌梗死模型。方法30只成年SD大鼠麻醉后，在自主呼吸条件下，于胸骨左缘第4肋间钝性分离肋间肌，暴露心脏，迅速结扎左冠状动脉前降支(LAD)建立心肌梗死模型。同时记录术前、术中及术后1、3d，1、2周的心电图变化;术后2周开胸，观察心脏大体形态的改变，LAD供血区出现明显发白的梗死区即为模型建立成功;同时取8只模型的心脏标本行组织病理学HE染色以证实模型建立。结果25只大鼠成功建立心肌梗死模型，模型存活率为83.33%。心电图监测显示LAD结扎后出现R波峰减低，随即出现ST段抬高和ST-T融合，30min后可见病理性Q波。术后2周开胸，可见缺血区心肌颜色发白，室壁运动减弱。HE染色可见心肌梗死区心肌细胞消失，代之大量纤维和胶原组织增生，梗死周边区残存心肌排列紊乱、肌丝断裂，间质结构破坏、纤维组织增生。结论本方法可在非人工通气条件下，快速、简单、有效地建立大鼠急性心肌梗死模型。
【关键词】 非人工通气;心肌梗死;动物模型;大鼠
ABSTRACT: ObjectiveTo establish a model of acute myocardial infarction in rats without artificial ventilation.MethodsAfter anesthesia， left thoracotomy was performed in 30 adult SD rats by blunt dissection of intercostal muscles of the fourth intercostal space， and the left anterior descending (LAD) coronary artery was ligated to establish a model of myocardial infarction under spontaneous breathing condition. Changes of electrocardiography were recorded during the operation and 1 day， 3 days， 1 week and 2 weeks after model establishment. Histomorphological changes of the heart were observed under thoracotomy 2 weeks after operation. Pale appearance in ischemic myocardium would suggest the successful establishment of myocardial infarction and eight models were killed to determine pathological changes of myocardial infarction by HE staining.ResultsTwenty-five models of myocardial infarction were successfully established with a survival rate of 83.33% 2 weeks after operation. After ligation of LAD， the ST segment elevated and the pathological Q wave appeared after 30 min. Two weeks after establishment of myocardial infarction model， ischemic myocardium showed pale appearance and the motion of ventricular wall became weaker. HE staining revealed that cardiomyocytes disappeared and were replaced by fibrous tissues and collagen. Remnant cardiomyocytes were arranged disorderly and myofibers were fractured， with interstitial damage and fibrous tissue hyperplasia.ConclusionBy this method， a model of acute myocardial infarction in rats can be established simply and effectively without using artificial ventilation.
KEY WORDS: non-artificial ventilation; myocardial infarction; animal model; rat
急性心肌梗死是严重危害人类健康的重大心血管疾病。近年来，通过干细胞移植修复受损心肌成为新的研究热点，大量临床试验及动物实验研究表明干细胞移植可改善心肌梗死后的心脏功能[1-5]，而建立心肌梗死动物模型则成为深入研究干细胞移植修复心肌损伤的重要基础。对于小动物而言，此模型的制备较多采用气管插管呼吸机辅助正压通气和剪断胸骨或肋骨而开胸造模，其损伤较大、操作复杂、需时较长，影响模型存活率;特别是心肌梗死后进行心肌内细胞移植研究时，需心肌梗死后短时间内再次开胸，因创伤很大而严重影响了模型的存活率。因此，本研究探讨在非人工通气条件下以较小的创伤且简单、快速地建立大鼠急性心肌梗死动物模型的方法。
1材料与方法
1.1实验动物2～3月龄健康雄性SD大鼠30只，体重200～250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，所有动物已得到动物实验管理委员会的批准，并符合动物实验管理条例和美国NIH发布的实验动物应用和保护指南。
1.2仪器与试剂BL-420生物机能实验系统购于成都泰盟科技有限公司;BX51型正置光学显微镜购于日本Olympus公司;HM325石蜡切片机购于德国MICROM公司;水合氯醛购于西安化学试剂厂;苏木精和伊红购于上海化工试剂厂。
1.3模型的建立选取30只健康成年SD大鼠，称重后，100g/L水合氯醛以3mL/kg的剂量腹腔注射麻醉。常规备皮、消毒、铺巾，沿胸骨左缘剪开皮肤，钝性分离胸大肌和前锯肌。助手于胸骨左缘第4肋间用血管弯钳稍用力穿透肋间肌进入胸腔，并迅速沿肋间隙方向撑开血管钳而钝性分离肋间肌;术者用另一血管弯钳垂直肋间隙撑开肋骨，暴露心脏。助手左手拇指与食指置于两侧胸部，右手食指置于左肋弓缘下，适当用力将心脏快速挤出;术者迅速在左心耳与肺动脉圆锥交界处平左心耳下缘2mm处，以7-0无损伤缝合线结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery， LAD)近端。进针深度1.5mm左右，结扎后立即将心脏放回心腔并置入接注射器的塑料细管，迅速对合、捏紧皮肤，抽出胸腔内气体，立即拔管并行胸外按压及两侧胸部间断挤压，心电图观察心律正常且呼吸平稳后，换用直钳夹紧对合的皮肤，缝合皮肤。伤口消毒，肌肉注射青霉素钠，每天10万单位，连续3d，预防感染。
1.4心电图监测采用BL-420生物机能实验系统的血流动力学模块于术前、术中及术后1、3d，1、2周动态记录肢体标Ⅱ导联心电图变化。
1.5心脏大体形态及组织病理学观察模型制备后2周，打开胸腔，观察LAD供血区的室壁颜色变化、梗死面积、搏动幅度改变。模型成功标准：LAD供血区可见颜色明显发白的心肌梗死区，与正常心肌形成明显分界。为进一步观察室壁厚度变化及进行组织病理学染色，处死8只大鼠，取下心脏，肝素生理盐水冲净残血，垂直于心脏纵轴环切心室，观察梗死区室壁厚度变化。同时，快速、准确切取心肌梗死区组织，40g/L多聚甲醛固定，然后行组织修整、洗涤、乙醇逐级脱水，二甲苯置换出组织中乙醇，石蜡包埋，以6μm切取组织薄片，苏木精-伊红染色、封固和光镜观察。
2结果
2.1模型存活率的分析选取30只大鼠制备心肌梗死模型，术后2周，25只存活并成功建立了心肌梗死模型，存活率为83.33%。其中，1只因麻醉过量于LAD结扎前死亡;2只因LAD结扎后出现室性心动过速和(或)心室颤动而死亡，1只因暴露心脏时损伤肺脏而死于呼吸衰竭;1只因LAD结扎不确切而未发生心肌梗死。
2.2模型建立前后心电图的改变LAD结扎前，心电图正常(图1A);LAD结扎后5min，心电图呈现心率减慢，QRS波R峰值减低，随即出现ST段抬高和ST-T融合，大于0.3mV(图1B);持续30min，出现明显的病理性Q波(图1C);术后2周，心电图近乎正常，T波相对低平(图1D)。
2.3心脏大体形态及组织病理学的改变心肌梗死模型制备2 周后开胸，可见明显的心肌梗死区，其颜色发白，与周围心肌形成明显的分界(图2A)，且梗死局部室壁运动减低或消失，提示急性心肌梗死模型建立成功。取心脏横切面，可见梗死区明显变薄，瘢痕组织形成(图2B)。HE染色可见梗死区心肌细胞丢失殆尽，代之大量纤维及胶原组织增生，梗死周边区残存的心肌结构不完整，肌纤维排列紊乱，肌丝断裂，间质网络结构破坏，代之纤维组织增生(图2C)。图1模型建立前、后心电图的改变Fig.1 Changes of electrocardiography before and after establishing the model of myocardial infarctionA：LAD结扎前显示心电图正常;B：LAD结扎后5min显示ST段抬高，大于0.3mV;LAD结扎后30min出现病理性Q波;D：心肌梗死模型建立后2周，心电图近乎正常，T波相对低平。图2心肌梗死时组织的病理学改变Fig.2 Pathological changes of myocardial infarctionA：心肌梗死区颜色发白，与周围心肌形成明显的分界(箭头所示);B：梗死区明显变薄，瘢痕形成(箭头所示);C：HE染色(×200)。梗死区心肌细胞丢失，纤维及胶原组织增生(箭头所示)，周边区残存的心肌结构不完整，肌纤维排列紊乱，肌丝断裂，间质网络结构破坏，代之纤维组织增生(三角所示)。
3讨论
通过结扎冠状动脉制作急性心肌梗死动物模型因相对电凝[6]、冷冻[7]、药物诱导[8]、化学物诱导[9]等方法更符合临床心肌梗死发生的病理改变而成为心肌梗死动物模型最主要的制作方法。对于大的实验动物而言，可通过冠状动脉栓塞或封堵法[10-11] 建立心肌梗死动物模型，其创伤小，存活率高，已成为一种重要的模型制作方法。但是，此方法需要特殊设备且动物价格昂贵。因此，小动物模型的应用更为广泛。对于小动物而言，此模型较多采用气管插管呼吸机辅助正压通气和剪断胸骨或肋骨而开胸造模，其操作复杂，损伤较大[12]。本研究探讨了在非人工通气条件下，以较小创伤、快速有效地建立大鼠急性心肌梗死模型，为进一步研究干细胞移植修复心肌损伤奠定了基础。
本方法避免了气管切开和剪断胸骨或肋骨，通过快速钝性分离肋间肌而开胸暴露心脏，整个操作过程无明显出血，创伤很小，利于术后恢复及再次开胸进行心肌内干细胞移植。同时，本方法通过钝性撑开肋间隙并配合适当挤压而快速充分暴露心脏，使得手术视野暴露充分，利于结扎位置的准确定位和手术操作。而且，由于术中快速钝性分离肋间肌且撑开肋间隙时间短暂，心脏放回心腔后，肋间隙可自动闭合。同时，前锯肌和胸大肌因术中钝性分离，术后也自然复位而使胸壁自然闭合。整个操作过程无明显出血，不需逐层缝合肌肉，只需快速对合捏紧皮肤而关胸，使得整个手术操作需时较短，造模效率大幅提高，同时也利于术后恢复。因需时很短，操作必须快速准确。对术者而言，只要对大鼠LAD解剖位置熟悉，且与助手密切配合，此方法可以短时间内掌握。
本研究观察到影响模型建立成功的主要因素有：充分暴露心脏、快速准确定位并结扎LAD、关胸时抽出胸腔残余气体、术后心肺复苏。其中，最关键的是快速准确定位并结扎LAD。我们研究发现结扎位置选在左心耳与肺动脉圆锥交界处平左心耳下缘2mm处较佳。位置太高，梗死面积很大，术后1h内死亡率很高;位置太低，梗死面积不确切。同时，进针深度控制在1.5mm左右利于LAD的准确结扎。沿胸骨左缘第4肋间开胸利于心脏暴露，第5肋间开胸容易同时暴露肺脏，可干扰视野并增加肺脏损伤的风险。关胸时抽出胸腔残余气体，可恢复胸腔负压，利于呼吸恢复。术后心肺复苏也至关重要，因术中心跳和呼吸会受到短暂抑制，术后胸外按压及两侧胸部挤压，十分有助于心跳和呼吸的恢复。其他因素对模型建立成功也有一定影响。例如，动物体重在200～250g之间利于手术实施，动物太大，心脏不易暴露，容易嵌顿;动物太小，LAD解剖位置不明显，结扎时进针不易控制，且对手术的耐受性较差。此外，术后温度控制及预防感染对模型存活也有明显影响。
本研究前期尝试了在气管插管、呼吸机辅助的正压通气条件下，开胸建立心肌梗死模型，其损伤较大，需时较长，易引起呼吸道损伤，进而严重影响呼吸的恢复，总死亡率较高。本方法在非人工通气条件下，以较小的创伤开胸，简单快速地建立大鼠急性心肌梗死模型，成功率较高。提示通过本方法建立大鼠急性心肌梗死模型有效可行。这可为干细胞移植研究时心肌梗死模型的制作提供一种可靠的选择。
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