作者：何立群，黄迪，王云满，沈丽萍
【摘要】 目的研究丹酚酸B对马兜铃酸肾病肾小管间质病变的防治作用机制。方法运用马兜铃酸(aristolochic acid， AA)灌胃造成马兜铃酸肾病模型，将36只大鼠随机分成3组：模型组(n=12)，每日接受AA灌胃，剂量为5mg/(kg·d);治疗组(n=12)，每日接受AA灌胃\[5mg/(kg·d)\]后随即接受丹酚酸B(salvianolic acid， SalB)灌胃\[10mg/(kg·d)\];正常组(n=12)，每日接受同体积的生理盐水灌胃。药物处理持续8周。每周称量动物体重以调整用药剂量。第2、4、6、8周收集24h尿液标本，第8周末麻醉后摘取肾脏做病理检测，采用RT-PCR法测定肾组织基质金属蛋白酶9(MMP-9)、肾组织纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、ITGβ-1、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1) mRNA的表达。结果模型组较正常组肾间质明显增宽，间质细胞增多，胶原成分显著增加。与模型组比较，治疗组PAI-1、TIMP-1、ITGβ-1 mRNA的表达减弱，MMP-9 mRNA增加。结论自丹参中分离出的SalB对慢性马兜铃酸肾病肾小管间质性损伤有较强的抗纤维化作用。
【关键词】 马兜铃酸肾病;丹酚酸B;抗纤维化;大鼠
ABSTRACT: ObjectiveTo study the mechanism of salvianolic acid B in preventing and treating renal tubulointerstitial injury caused by aristolochic acid. MethodsRat model of aristolochic acid nephropathy was induced by intragastric administration of aristolochic acid. Thirty-six rats were randomly pided into model group， treatment group and normal control group. In model group， twelve rats received aristolochic acid [5mg/(kg·d)] by gastric lavage each day. In treatment group， after gastric lavage of aristolochic acid [5mg/(kg·d)]， the twelve rats received gastric lavage of salvianolic acid B [10mg/(kg·d)] each day. Gastric lavage of the same volume of saline was given to the 12 rats in normal control group each day. The above-mentioned treatments lasted for 8 weeks. Each week the animals were weighed to adjust the dosage. Overnight urine samples were collected from each rat at week 2， week 4， week 6 and week 8. At the end of week 8， kidneys were removed from each group under anesthesia for pathological measurement. The expressions of MMP-9， PAI-1， ITGβ-1， MCP1 and TIMP-1 mRNA in renal tissues were detected by RT-PCR.
ResultsCompared with normal group， model group had significantlywidened renal interstitia and increased mesenchymal cells and collagen composition. Compared with those in model
中草药肾病(Chinese herb nephropathy， CHV)是一种与食用中草药(aristoloohia fangchi)导致肾病相关的一类疾病(肾功能缺失、肾小管状萎缩和间质纤维化)。我国尚缺乏CHV的动物模型。本研究试图建立类似人类CHV主要特征的大鼠模型，用这一模式生物不仅可以测试马兜铃酸(aristolochic acid， AA)药物剂量与肾纤维化的关系，而且又可作为筛选抗药物成分的动物模型，进而防治肾纤维化这一难以解决的关键问题。
以往的研究显示丹酚酸B(salvianolic acid B， SalB)能降低马兜铃酸肾病模型大鼠的尿β2-微球蛋白、尿NAG、视黄醇结合蛋白和减低血清肌酐、尿素氮、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白在肾小管间质的表达[1-3]，有改善肾近曲小管功能的作用。本研究进一步从肾组织形态方面观测SalB对肾小管间质纤维化的作用;并从肾组织纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的表达等角度对SalB抑制肾纤维化的作用环节进行研究。
1材料与方法
1.1实验试剂AA：Sigma-Aldrich公司，含290g/L AAⅠ和610g/L AA Ⅱ。SalB：由中国科学院上海药物研究所从崇明岛人工栽培的丹参中分离提取和鉴定。DEPC：博彩生物技术公司提供;Trizol、RNAsin(40u/μL)、M-MuLV(200u/μL)：Invitrogen提供;Taq polymerase(5u/μL)和dNTP(each 10mmol/L)：博彩生物技术公司提供;引物由上海博彩生物技术有限公司合成;DNA Marker：100bp，由天为时代生物科技提供。
1.2实验仪器PCR基因扩增仪9600型(PE公司生产);DY-1型电泳仪(上海医用分析仪器厂);FR-2000型计算机图像分析系统(上海复日科技有限公司FR-2000型)。
1.3方法36只雄性2月龄SD大鼠，采购自西普尔-必凯实验动物有限公司，在上海中医药大学附属曙光医院动物房(清洁级)饲养。第0周，动物送抵动物房饲养。在整个实验周期中，动物能够自由取食和饮水。经过1周的适应期，进行体重均衡后，将实验动物随机分成3组进行药物处理。模型组(n=12)：每日接受AA灌胃，剂量为5mg/(kg·d)，灌胃体积为2mL/d。治疗组(n=12)：每日接受AA灌胃[5mg/(kg·d)]后随即接受SalB灌胃[10mg/(kg·d)]，灌胃总体积胃4mL/d。AA在灌胃前以生理盐水配制成悬浊液备用，SalB在灌胃前以生理盐水溶解备用。正常组(n=12)：每日接受生理盐水灌胃，灌胃体积为2mL/d。药物处理持续8周。每周称量动物体重以调整用药剂量和记录体重变化趋势。在第2、4、6和8周末将各组大鼠置于啮齿类动物代谢笼中过夜采集尿液样本。在第8周末尿液样本采集完毕后，腹腔注射2g/L戊巴比妥溶液(2mL/kg体重)。待大鼠完全麻醉后，解剖，用腹主动脉采血的方式采集血液样本。然后立刻取出部分肾脏组织，用100mL/L甲醛溶液固定后，保存于-20℃备组织学研究用。每组随机抽取6只，取出肾脏组织，立刻用液氮冷冻保存在-4℃以备PCR实验使用。
1.4组织形态学观察取部分肾组织，石蜡包埋，切片，采用Masson染色观察肾组织。
1.5RT-PCR法测定肾组织MMP-9、TIMP1、PAI-1、ITGβ-1和MCP1 mRNA的表达引物见表1。表1引物序列表
1.6数据的分析数据以平均值±标准误差表示。3组之间的比较采用单因素方差分析ANOVA检验。任意2组间的比较采用LSD检验。上述统计步骤均由统计软件SPSS v.14.0完成。统计学显著性水平设定在α = 0.05。
2结果
2.1丹酚酸B对各组大鼠肾脏组织形态学的影响
正常组大鼠肾脏组织MASSON染色结果显示，胶原主要位于肾小管基膜、肾小囊、系膜区和肾小管的毛细血管周围，而肾小管周围的间质染色较少。MASSON染色结果可见：模型组与正常组比较，肾间质明显增宽，间质细胞增多，胶原成分显著增加;中药组胶原成分与模型组比较有显著下降(图1)。图1各组大鼠肾组织MASSON染色的病理变化Fig.1 The renal pathological changes in each group detected with Masson stain (×200)A：正常组;B：模型组;C：治疗组。
2.2丹酚酸B对各组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1、MCP-1、ITGβ-1和PAI-1 的mRNA表达的影响治疗组TIMP-1、 PAI-1、ITGβ-1 mRNA的表达减弱，MMP-9表达增加，与模型组比较有显著差异(表2)。表2MMP-9、TIMP-1、MCP-1、ITGβ-1和PAI-1的mRNA表达的比较
3讨论
CHV是一种与食用中草药导致肾病相关的一类疾病(肾功能缺失、肾小管状萎缩和间质纤维化)，我国尚缺乏中草药肾病的动物模型。尽管丹酚酸(一种丹参的水溶性有效成分)已显示具有抗纤维化、抑制纤维蛋白合成、抗凝、抗氧化的作用，但本研究通过进一步观察丹酚酸对马兜铃酸肾病模型[1]肾小管间质病变的防治作用，为在临床上已广泛使用的丹参及其有效成分丹酚酸拓宽其临床用药指征提供实验依据。
肾小管间质性纤维化是多种肾脏疾病发展进程的一种共同表现[4]。作为肾功能障碍的预测指标，许多临床和实验的研究证明肾小管间质性损伤的预测优于肾小球损伤[5-6]。间质纤维化发展的机制还不完全清楚，但认为在纤维生成和炎症性过程的进展中与几个细胞因子，如成纤维细胞、巨噬细胞以及细胞外基质(ECM)的蓄积有关[7]。
肾间质纤维化主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型间质胶原及Ⅳ型膜胶原的堆积。肾间质纤维化首先由各种因素引起肾小管间质损伤，继之单核巨噬细胞浸润到肾间质，释放大量细胞因子和生长因子及血管活性物质，早期细胞表达明胶酶MMP-9和MMP-2增加，降解基底膜(TBM)，使其完整性受到破坏，小管上皮细胞随之发生上皮间质转化(EMT)，表达α-SMA，重组肌动蛋白形成张力丝，获得游走力与侵袭力而成为肌成纤维细胞(MFB)，MFB大量生成ECM蛋白引起纤维化。在肾间质纤维化后期MMP-9及其他MMPs表达下降，同时PAI-1和TIMP-1表达增加，造成MMPs活性降低或MMPs/TIMPs比例下降，使ECM的降解减少。
整合素作为粘附分子是细胞表面的糖蛋白，作为ECM的受体，可指导细胞合成ECM，并介导细胞与ECM的粘附及信息传递，对维持组织正常结构和功能具有重要作用。含β1亚单位的整合素主要介导细胞与ECM成分之间的粘附[8]。慢性肾功能不全进行性恶化的病理表现为肾小球硬化和肾间质纤维化，系膜细胞增殖与ECM增多是导致肾小球硬化的关键性病理变化过程，在ECM增多的过程中ITGβ-1 mRNA发挥着重要的作用。
丹酚酸的基本结构为丹参素(即3，4-二羟苯乳酸)。SalB的分子式为C36h38O16，相对分子质量为718。它由三分子丹参素和一分子咖啡酸组成。其药理作用多样，主要为：①抗肝损伤、肝纤维化作用。SalB通过影响花生四烯酸级联过程，降低血清ALT和AST活性进而降低花生四烯酸代谢产物的总生成量[9]起到抗肝损伤和肝纤维化的作用。②防治动脉粥样硬化。SalB是一种抗氧化剂，并且能清除1，1-二酚-2-间三硝基偕腙基肼自由基，能有效阻止LDL的氧化作用，从而减轻动脉粥样硬化作用[10]。③诱导细胞凋亡。在血管形成术的动物模型中，发现SalB能诱导新血管内膜细胞的凋亡，从而可以防止新血管内皮增厚[11]。④抗肿瘤作用。用不同终浓度的SalB进行MTT实验，发现在5～80μg/mL的范围内，对HL-60细胞的生长和增殖有抑制作用，并且有显著的剂量效应[12]。
本研究结果显示，与正常组大鼠比较马兜铃酸肾病模型组大鼠发生了明显的肾小管功能异常和纤维化改变。同时，观察SalB对马兜铃酸肾病造模大鼠肾脏的疗效，肾组织胶原基质分解代谢的抑制作用明显减轻，防止了纤连蛋白的蓄积和肾小管间质的损伤。本研究的另一个主要发现是SalB对MMP-9的表达有正调节。MMP-9表达的增强与AA造模大鼠中蛋白酶水解活性的提高有关。本研究关于MMP-9的实验结果与CHENG等[13]的发现一致。目前，研究结果表明TIMP-1在AA所致的肾病中起重要的作用。TIMP-1在AA引起严重的肾小管间质纤维化的动物模型中表达明显增加。本研究发现SalB能改变马兜铃酸肾病造模大鼠的TIMP-1表达。表明SalB作为一种中药成分，在抑制肾脏纤维化进程中有潜力作为一种新的治疗因素。
总之，SalB(10mg/kg)显著改善肾小管间质功能与使肾组织中TIMP-1表达的减弱和MMP-9活性的增加，并且能通过增加MMP的活性和降低TIMP-1、PAI-I mRNA的活性来拮抗ITGβ-1 mRNA的致纤维化作用有关。因此，表明自丹参中分离出的SalB对慢性肾小管间质性损伤有较强的抗纤维化作用。
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