作者：张明鑫，周苏娜，王健生，叶尔买克，蔡惠，段小艺，石景森
【摘要】 目的检测核因子E2 p45相关因子2(Nrf2)与血红素加氧酶-1(HO-1)在原发性胆囊癌组织中的表达，探讨其与胆囊癌发生、发展的关系。方法采用免疫组化SP法检测59例原发性胆囊癌患者Nrf2和HO-1的表达水平。结果原发胆囊癌组织中Nrf2和HO-1表达的强阳性率分别为76.3%、80.7%。随着转移程度、Nevin分级以及病理分级的增加，Nrf2和HO-1的强阳性表达率增加，且具有统计学差异(P<0.05)。两者的强阳性表达与年龄、性别等临床特征无相关性;Nrf2和HO-1表达之间具有相关性(r=0.376，P<0.05)。结论Nrf2和HO-1在原发性胆囊癌组织中存在高表达，对胆囊癌的发生、发展起一定作用。
【关键词】 核因子E2 p45相关因子2;血红素加氧酶-1;原发性胆囊癌;免疫组织化学
ABSTRACT: ObjectiveTo detect the expression of nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase (HO-1)， and investigate its correlation with the genesis and development of primary gallbladder carcinoma. MethodsImmunohistochemistry (SP assay) was used to detect the expression of Nrf2 and HO-1 protein in 59 patients with primary gallbladder carcinoma.ResultsHighly positive expression rate of Nrf2 and HO-1 was 76.3% and 80.7%， respectively， in primary gallbladder. The expression of Nrf2 and HO-1 had a significant correlation with metastasis， Nevin staging， and differentiation (P<0.05)， but showed no significant association with sex or age. The expression of Nrf2 had a positive correlation with that of HO-1 (r=0.376， P<0.05). ConclusionBoth Nrf2 and HO-1 are overexpressed in primary gallbladder carcinoma and may play a certain role in the genesis and development of primary gallbladder carcinoma.
KEY WORDS: nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2 (Nrf2); heme oxygenase 1 (HO-1); primary gallbladder carcinoma; immunohistochemistry
核因子E2 p45相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2， Nrf2)是氧化应激中的关键转录因子，通过上调抗氧化相关基因的表达清除代谢毒物、致癌物等以维持机体的氧化还原稳态。因此，激活Nrf2途径对预防肿瘤具有重要意义[1]。近来的研究发现，Nrf2及其下游基因在许多肿瘤细胞株及组织中过度表达，促进了肿瘤的生长，而且Nrf2在耐药细胞中表达上调，可能和肿瘤的获得性耐药相关[2]。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1， HO-1)是Nrf2众多下游基因之一，可氧化血红素生成胆绿素、一氧化碳和二价铁离子。HO-1通过减轻氧化损伤和减轻炎症反应、抑制细胞凋亡、调节细胞分化来维持细胞稳态[3]。研究发现，HO-1在肿瘤细胞中表达上调且与肿瘤发生、转移以及耐药相关[4]。目前，国内外有关Nrf2和HO-1表达与胆囊癌关系的研究尚未见报道。本研究通过免疫组织化学法检测Nrf2和HO-1在原发性胆囊癌中的表达情况，探讨Nrf2和HO-1在胆囊癌发生、发展中的临床意义。
1材料与方法
1.1材料收集西安交通大学医学院第一附属医院2000～2006年间胆囊癌患者的组织标本，共59例，其中男17例，女42例，年龄36～83岁，中位年龄60.8岁;所有病例经HE染色证实为原发性胆囊癌，病理类型：腺癌54例，鳞癌5例。所取标本用甲醛固定，常规石蜡包埋，制备4μm切片，行免疫组化检测。
1.2Nrf2和HO-1的免疫组化染色Nrf2兔抗人多克隆抗体为美国Santa公司产品(货号：sc-722)，按1∶200稀释后作为一抗;HO-1兔抗人多克隆抗体为美国Abcam公司产品(货号：ab52947)，按1∶500稀释后作为一抗;通用型SP系列工作液试剂盒(SP-9000)及DAB显色试剂盒(ZLI-9032)购自中山金桥生物公司。采用免疫组化SP法，染色步骤严格按照说明书进行。以已知阳性反应片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3免疫组化染色结果的判定由2位高年资的病理科医生独立评定，当出现分歧时共同评定。蛋白表达均以细胞质或细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，具体方法如下：每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数1000个细胞，用各视野中阳性细胞数的平均百分数进行计分：0%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，>75%为4分。染色强度以多数阳性细胞呈现的染色特征为标准计分：细胞未着色为或呈淡黄色为0分，棕黄色为1分，棕褐色为2分。为进行统计分析，以超过25%细胞呈棕褐色为强阳性，余为弱阳性。
1.4统计学分析计数资料的组间比较采用卡方检验，应用SPSS 13.0统计软件对结果进行处理，检验水准为α=0.05。
2结果
2.1Nrf2与HO-1在原发性胆囊癌中的表达情况Nrf2与HO-1呈散在分布的淡黄色或棕褐色颗粒，主要定位于细胞核中，散见于细胞质中。阳性细胞呈片状分布的棕褐色颗粒，阴性对照片中未见棕黄色颗粒(图1)。Nrf2与HO-1的强阳性表达率分别为76.3%和80.7%。随着转移程度、Nevin分级以及病理分级的增加，两者的强阳性表达率增加，且具有统计学差异(P<0.05)。而不同年龄、性别的原发性胆囊癌患者的Nrf2与HO-1强弱表达无统计学差异(表1)。图1Nrf2与HO-1在原发性胆囊癌中的表达Fig.1 The expression of Nrf2 and HO-1 in primary gallbladder cancer (SP， ×200)A：Nrf2强阳性表达细胞;B：HO-1强阳性表达细胞;C：HO-1弱阳性表达细胞;D：阴性对照细胞。表1Nrf2、HO-1表达与临床病理指标的关系
2.2Nrf2表达与HO-1表达之间的关系采用卡方检验对原发性胆囊癌组织中Nrf2与HO-1表达水平的关系进行分析，结果显示在45例Nrf2强表达的标本中，有39例HO-1强表达，在14例Nrf2弱表达的标本中，有7例HO-1弱表达;二者在统计学上具有相关性(P<0.05)，χ2换算成Pearson列联系数r为0.376，相关性较弱。
3讨论
Nrf2作为结合在β-珠蛋白基因启动子NF-E2重复序列的因子被克隆出，属于转录因子CNC家族，含有亮氨酸拉链结构。Nrf2的活性由负性调节蛋白Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)精确调控，Keap1与肌动蛋白细胞骨架结合将Nrf2固定在细胞质，进一步通过Keap1-Cul3途径介导了Nrf2的泛素化和蛋白酶降解。当细胞暴露于氧化应激或者化学预防剂时，Nrf2从Keap1中解离，易位进入细胞核，与Maf结合成异二聚体，最终激活了ARE介导的下游基因的表达[5]。Nrf2的激活能够保护细胞免受外源性刺激，在预防肿瘤发生中发挥重要作用[6]。然而，近来的一系列研究发现Nrf2在肿瘤中主要定位于细胞核，并且表达上调，在肿瘤发生及耐药中发挥作用[2]。进一步研究发现，肿瘤中Keap1常发生突变，导致Keap1的失活或低表达，失去对Nrf2的负性调节，从而导致了Nrf2的核定位、表达上调及下游基因的转录激活[7-9]。HO-1作为Nrf2的下游基因之一，在多种肿瘤中过度表达，与肿瘤过度增殖、耐药、血管生成、转移等关系密切[4]。KWEON等[10]报道Nrf2依赖的HO-1的高表达是肺癌A549细胞对表没食子儿茶素没食子酸酯治疗耐受的主要原因，KIM等[11]也证实HO-1在MAPK-Nrf2信号途径调节下降低肺癌A549细胞对顺铂的敏感性。因此，Nrf2-HO-1途径可作为肿瘤治疗的新靶点。
本实验发现，原发性胆囊癌中Nrf2主要定位在细胞核，散见于细胞质，与之前其他肿瘤中的研究报道一致[2];Nrf2和HO-1的强阳性表达率分别为76.3%和80.7%，而且随着转移程度、Nevin 分级以及病理分级的增加，强阳性表达率增加，且具有统计学差异(P<0.05)。
Nrf2的定位说明在胆囊癌中过度激活，并导致了下游基因HO-1的过度表达，两者可能参与了胆囊癌的发生、发展。同时，Nrf2与HO-1在胆囊癌组织中的表达具有相关性(P<0.05，r=0.376)，进一步证实了Nrf2对HO-1的调控。胆囊癌的早期诊断率较低，能进行根治性手术的患者比例少，故大部分患者需要进行化学治疗。但是，多数患者的化疗敏感性较差。因此，提高胆囊癌化疗的敏感性是改善不良预后、提高生存的关键。基于在化疗耐药中的作用以及其在胆囊癌中的高表达，Nrf2-HO-1途径可以作为胆囊癌治疗的新靶点，通过抑制Nrf2以及HO-1的表达，可能会提高化疗的疗效。SHIBATA等[9]在细胞层次上进行了有意义的尝试，证实了通过RNA干扰技术下调Nrf2的表达能够增加胆囊癌细胞株对5-氟尿嘧啶的敏感性。下一步工作主要是明确Nrf2和HO-1在胆囊癌中精确作用机制及在化疗耐药中的意义，为早日临床应用奠定基础。
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