作者：赵琳，王峰，孙乃学，熊全臣，王建明
【摘要】 目的观察比较新鲜羊膜和保存羊膜移植在兔角膜急性碱烧伤眼表重建中的作用，并探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血小板源性生长因子(PDGF)的疗效。方法建立兔角膜急性碱烧伤模型，设左眼为对照组，右眼为治疗组，并于24h内行新鲜羊膜或保存羊膜移植术(12眼/组)。术后观察双眼形态及角膜新生血管变化，酶联免疫吸附法检测房水中TNF-α的含量，免疫组化法检测角膜组织中PDGF-BB蛋白的表达情况。结果与对照组比较，治疗组炎症反应轻，角膜溃疡范围小，上皮再生速度快，新生血管长度短(P<0.05)。治疗组房水中TNF-α含量低于同期保存羊膜移植组和对照组，且下降速度快，角膜组织中PDGF-BB蛋白表达升高(P<0.05)。与保存羊膜移植组比较，新鲜羊膜移植组炎症反应更轻，TNF-α下降速度更快(P<0.05)，PDGF-BB表达水平更高(P<0.05)。结论在角膜急性碱烧伤眼表重建中，新鲜羊膜较保存羊膜效果更好，其作用与抑制TNF-α水平、促进PDGF表达有关。
【关键词】 碱烧伤;羊膜移植术;肿瘤坏死因子-α;血小板源性生长因子
ABSTRACT: ObjectiveTo compare the therapeutic effect of fresh amniotic membrane transplantation (f-AMT) and preserved amniotic membrane transplantation (p-AMT) in ocular reconstruction of early corneal alkali burns model and to explore the role of tumor necrosis factor α (TNF-α) and platelet derived growth factor (PDGF) in the corneal reparation.MethodsTwenty-four rabbits (48 eyes) were used to establish corneal alkali burn models with 0mmol/L sodium hydroxide. Within 24 hours， f-AMT or p-AMT was performed in the right eyes (12 eyes/group， therapy group)， and the left eyes served as controls. The morphologic changes of the eyes and the neovascularization (CNV) length at the top of corneal surface were observed. TNF-α concentration of aqueous humor from the anterior chamber was measured by enzyme linked immunosorbent assay method after AMT procedure. Also， the PDGF-BB (a marker of PDGF) protein expression of corneal tissue was observed by immunohistochemistry method.ResultsCompared with those in control group， the AMT eyes showed moderate corneal inflammation， distinctive ulcer boundary， quick epithelium regeneration and shorter CNV length. In therapy group， TNF-α concentration was lower significantly and decreased more quickly than that in control group (P<0.05). The PDGF-BB protein expression increased after ATM procedure. Comapred with therapy group， f-AMT group had milder inflammatory reaction， lower TNF-α concentration and higher PDGF-BB expression than those in p-AMT group (P<0.05).ConclusionFresh amniotic membrane transplantation is better than preserved amniotic membrane transplatation in ocular reconstruction of early-stage corneal alkali burns， which may be related to its inhibition of TNF-α concentration and increase of PDGF expression.
KEY WORDS: alkaline burn; amniotic membrane transplantation; tumor necrosis factor α; platelet derived growth factor
近年来，羊膜移植在临床上用于眼表重建取得了较为满意的疗效。多数学者认为新鲜羊膜移植效果较好[1-2]，但也有学者认为低温保存羊膜效果相似[3-5]。我们建立兔角膜急性碱烧伤模型，比较两者在疗效上的差异，并探讨肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α， TNF-α)和血小板源性生长因子(platelet derived growth factor， PDGF)在羊膜移植眼表重建中的作用。
1材料与方法
1.1实验动物及分组健康新西兰白兔24只共48眼(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体重1.5～2.0kg，雌雄不限。实验前用显微镜、裂隙灯等观察无眼前节病变。每只兔行双眼碱烧伤后，选择左眼为对照眼，右眼为治疗眼。治疗眼根据移植类型分为新鲜角膜移植组(f-AMT)和保存羊膜移植组(p-AMT)(12眼/组)。本研究所使用的动物遵循国家有关实验动物保护条例，并经得动物实验管理委员会批准。
1.2羊膜的制备本实验所用羊膜均取自健康剖宫产妇的胎盘，且排除艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒及其他传染病。产后立即无菌条件下取出胎盘，清除血凝块，钝性分离获取羊膜。将处理干净的羊膜修剪成3cm×3cm大小，新鲜羊膜置于含4mg/kg庆大霉素平衡液中，4℃保存。保存羊膜置于体积比为1∶1的甘油∶DMEM培养液中，-80℃封闭保存，保存期2月。实验所用羊膜已征得产妇知情同意并经单位伦理委员会批准后使用。
1.3碱烧伤模型的制备5g/L盐酸丙美卡因表面麻醉，置开睑器，充分暴露眼表，以浸有1mmol/L NaOH溶液、直径6mm的单层圆形滤纸片置于兔角膜表面中央，70s后取下，立即用40mL生理盐水连续冲洗眼角膜表面2min。
1.4羊膜移植方法角膜碱烧伤后24h内行移植手术，步骤如下：氯胺酮50mg/kg和异丙嗪25mg/kg等量混合共4mL背部皮下注射全身麻醉。铺孔巾，开睑器打开右眼。刮除角膜表面坏死组织，沿角膜缘360°环形剪开球结膜，暴露前部巩膜床3mm。将备好的羊膜上皮面向上，平铺于角膜表面，边缘超出角膜缘3mm，10-0无损伤缝线间断缝合羊膜与球结膜，并固定于角膜缘外2mm处浅层巩膜，使羊膜紧贴于角膜创面，剪去多余羊膜。结膜囊内涂红霉素眼膏，术后每日双眼滴氯霉素滴眼液2次。对照眼仅剪开球结膜，暴露前部巩膜床3mm，余同治疗眼。
1.5标本采集术后第7、14、21、28天，每组随机对6只兔眼从角膜缘穿刺抽取0.1mL房水，测定房水中TNF-α含量。术后第14、28天，用空气栓塞法处死实验兔，取角膜组织，中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，行HE染色及免疫组化检测PDGF-BB蛋白的表达。
1.6观察方法①除观察术眼是否感染、羊膜是否在位、新生血管发生情况外，术后第7、14、21、28天用裂隙显微镜观察并测量角膜上方12∶00处新生血管(corneal neovascularization， CNV)长度，荧光素钠法观察角膜上皮缺损情况。②TNF-α含量的测定：采用双抗体夹心ABC-ELISA法，以自动酶标仪492nm处测吸光值，并根据标准曲线计算房水中TNF-α含量(兔TNF-α定量ELISA试剂盒购自上海森雄公司)。③PDGF-BB蛋白表达的检测：采用免疫组化SP法检测角膜组织中PDGF表达，步骤如下：石蜡切片厚4μm，脱蜡水化，3mL/L过氧化氢孵育20min，50mL/L正常山羊血清孵育5min，加入PDGF-BB一抗(1∶70，北京中杉)，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育30min，DAB显色，自来水洗终止，复染，封片。PDGF-BB蛋白阳性表达为胞膜和胞质阳性。染色淡黄色为弱阳性(+)，棕黄为阳性()，深棕为强阳性()。
1.7统计学处理应用SPSS13.0统计软件包处理数据资料。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析及t检验，等级资料比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1角膜组织病理学改变所有眼碱烧伤模型全部成功建立，烧伤24h后可见角膜中央区出现与滤纸片相同直径、边界清晰的圆形灰白色混浊。烧伤后第7天，对照眼结膜充血水肿明显，炎性反应重，分泌物多;角膜基质弥漫水肿、增厚，角膜混浊区域面积增大、边界模糊、表面粗糙，部分眼角膜中央出现较深溃疡。14d充血水肿开始减退，溃疡面积及深度逐渐收缩。至28d时结膜及角膜基质仅有轻度充血水肿，角膜中央溃疡已修复，并最终发展为角膜白斑。治疗组病理变化过程与对照眼相似，但程度明显减轻。术后7d角膜烧伤区域分泌物少，边界清楚，无扩大倾向;14d烧伤区域进一步局限，角膜溃疡无扩大倾向;21d角膜及结膜仅有轻度水肿，溃疡进一步缩小变浅，周围界限清晰;28d羊膜与下方角膜基质融合，角膜组织无明显混浊。与p-AMT组比较，f-AMT组炎症反应程度弱，烧伤区范围局限，溃疡愈合速度快。另外，f-AMT组于术后14d，p-AMT组于术后10d逐渐出现部分羊膜的溶解吸收，p-AMT组吸收速度快于f-AMT组，至观察期结束时，p-AMT大部分羊膜被完全溶解吸收，而f-AMT组仍可观察到溶解吸收过程，两组均未见羊膜感染脱落。
2.2角膜CNV观察于术后第7、14、21、28天对角膜缘12∶00处CNV进行长度测量，结果发现，术后7～28d，对照组CNV长度持续大于治疗组，差异具有统计学意义(P<0.05)。f-AMT组血管再生速度较p-AMT慢，CNV长度短，术后第14天和第28天，两组差异具有统计学意义(P<0.05，图1)。图1各组CNV长度的比较Fig.1 Corneal neovascularization length in different groups (n=6)
2.3房水中TNF-α含量的变化术后第7天，对照组、p-AMT组和f-AMT组房水中TNF-α含量平均为(362.96±28.54)ng/L、(315.50±19.75)ng/L和(294.02±16.24)ng/L，均处于最高峰，且差异无统计学意义(P>0.05)。此后逐渐下降，以f-AMT组下降最快，p-AMT组次之，对照组最慢。至术后第28天，TNF-α含量分别为(283.45±19.91)ng/L、(140.57±11.52)ng/L和(82.63±7.46)ng/L，差异具有统计学意义(P<0.05)。在同一时间点，对照组TNF-α含量最高，p-AMT组次之，f-AMT组最低，差异具有统计学意义(P<0.05，图2)。图2各组房水中TNF-α含量的变化Fig.2 Changes of TNF-α concentration in aqueous humor in different groups (n=6)
2.4角膜组织PDGF的表达烧伤后第14天，对照眼仅部分角膜上皮细胞及基质层PDGF-BB呈阳性表达，第28天表达程度逐渐降低。治疗组PDGF-BB表达较对照组增强，以f-AMT组表达更明显，至术后第28天，大部分兔眼角膜上皮细胞及基质层PDGF-BB仍呈阳性表达(图3)。经统计学分析，差异具有显著性(P<0.05，表1)。表1治疗眼与对照眼角膜PDGF-BB的表达情况
3讨论
虽然20世纪90年代就有保存羊膜用于眼表重建的成功报道[6]，但新鲜羊膜和保存羊膜优劣之争并未停止。支持新鲜羊膜移植者认为，由于新鲜羊膜中含有较多的生物活性分子，如多种生长因子、神经营养因子、基质金属蛋白酶抑制剂及凋亡抑制因子等，可促进受体上皮细胞移行粘附、增殖分化，阻止受体基质细胞凋亡，促进受体残存的神经末梢的修复[7-8];另外早期新鲜羊膜移植术可有效抑制角膜内急性炎症反应，抑制自由基的生成和增强超氧化物歧化酶的活力，减轻自由基对角膜组织的损伤，具有比保存羊膜更强的抑制新生血管功能，可防止角膜的血管化[9-10]。因此，含活性上皮的新鲜羊膜可能有更佳的修复重建效果。也有人认为，新鲜羊膜比保存羊膜虽具有更强的生物活性作用，但也具有更高的免疫原性和更强的刺激性，可能对角膜的修复不利[11]。最近的一项研究提示，和保存羊膜一样，新鲜羊膜移植也具有良好的免疫相容性和组织相容性，且新鲜羊膜在眼表重建早期，可直接为创面组织提供完整连续表面，防止基底膜暴露和胶原溶解，为残存的眼表干细胞增殖、移行并覆盖移植物表面创造时机和缓冲，相对于灭活羊膜提供给受体的死亡组织支架具有一定的优势[12]。眼表上皮的完整性对减轻眼表炎症和防止角膜基质溶解非常关键，而完整羊膜可更好地维持干细胞特性[13]。在研究中我们发现，新鲜羊膜溶解吸收出现时间较晚，速度较慢，因此获得眼表稳定时间长;而保存羊膜出现溶解吸收早，速度快，眼表稳定时间低于新鲜羊膜移植组。与此同时，新鲜羊膜移植组眼内炎症反应轻，角膜组织修复速度快，并未出现明显的排斥反应，相反，保存羊膜溶解吸收更为明显，推测与其深低温保存后脆性增加有关。因此，从眼表稳定角度分析，新鲜羊膜移植作用更佳。
我们早期的研究表明，眼部碱烧伤后，局部角膜基质中可见大量的多形核白细胞浸润，房水细胞数量增多，TNF-α含量增加;而羊膜移植可明显减少角膜基质中白细胞浸润和房水细胞数目，促进角膜修复[14]。本研究表明，新鲜羊膜移植在碱烧伤眼表重建疗效上略优于保存羊膜移植，表现为新鲜羊膜移植组眼部炎症反应轻及减轻组织损伤、溃疡愈合速度快。
TNF-α在碱烧伤后早期水平迅速增加，而后期由于房水中单核细胞继续分泌大量的TNF-α，致TNF-α在烧伤后愈合过程中一直处于较高水平，可加重组织损伤，其表达水平与眼内炎症程度密切相关[14-15]。因此，降低房水TNF-α水平，对减轻眼内炎症，促进角膜基质的修复至关重要。本研究结果显示，虽然对照眼房水中TNF-α水平随时间推移亦呈下降趋势，但治疗组房水中TNF-α水平下降速度更快，尤其以新鲜羊膜移植组更为明显，术后14d时约为对照组的50%、保存羊膜移植组的70%，而28d时，仅为对照组的25%、保存羊膜组的50%，表明新鲜羊膜移植对降低房水中TNF-α水平具有更明显的作用。这与我们以前的研究结果一致[14]。
PDGF在正常角膜上皮仅有少量表达，损伤后表达增加，能促进角膜细胞的分裂增殖。本研究显示，羊膜移植组术后PDGF-BB的表达，无论在上皮细胞层，还是在基底层，均显著高于对照组，而新鲜羊膜移植组表达更强，持续时间更长，第28天时大部分兔眼角膜上皮细胞及基质层PDGF-BB仍呈阳性表达，同一时间保存羊膜移植组表达较新鲜羊膜组减弱，而对照组仅上皮层有微弱表达，基质层已基本无表达。PDGF-BB表达量的增减变化与角膜损伤修复的病理变化过程是一致的，提示PDGF-BB可能在角膜的损伤和修复过程中发挥重要作用。羊膜移植对PDGF-BB的表达起到有效的促进作用，而新鲜羊膜由于可能含有更多的活性因子，对上皮细胞的附着及移行、增殖、分化都起着促进作用，可以更好地发挥PDGF-BB的作用。
参考文献
\[1\]王峰，孙乃学，熊全臣，等. 新鲜羊膜移植治疗早期重症眼部烧伤 \[J\]. 眼科新进展， 2003， 23(4):278-279.
\[2\]杨蕊，王峰，孙乃学，等. 新鲜羊膜移植在结膜囊成形术中的应用 \[J\]. 中国修复重建外科杂志， 2004， 18(4):277-280.
\[3\]BAUM J. Thygeson lecture. Amniotic membrane transplantation: why is it effective \[J\]? Cornea， 2002， 21(4):339-341.
\[4\]张映萍，谢梅芬，何时兰，等. 新鲜羊膜与保存羊膜移植治疗严重眼表疾病疗效比较 \[J\]. 眼科新进展， 2006， 6(1):51-53.
\[5\]周世有，袁进，陈龙山，等. 新鲜和保存羊膜移植重建结膜眼表的临床对比研究 \[J\]. 眼科学报， 2008， 24(1):39-43.
\[6\]TSENG SCG， PRABHASAWAT P， LEE SH. Amniotic membrane transplantation for conjunctival surface reconstruction \[J\]. Am J Ophthalmol， 1997， 124(6):765-774.
\[7\]UCHIDA S， SUZUKI Y， ARAIE M， et al. Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells \[J\]. Neurosci Lett， 2003， 341(1):1-4.
\[8\]BARABINO S， ROLANDO M， BENTIVOGLIO G， et al. Role of amniotic membrane transplantation for conjunctival reconstruction in ocular-cicatricial pemphigoid \[J\]. Ophthalmology， 2003， 110(3):474-480.
\[9\]ARORA R， MEHTA D， JAIN V. Amniotic membrane transplantation in acute chemical burns \[J\]. Eye， 2005， 19(3):273-278.
\[10\]周世有，陈家祺，刘祖国，等. 羊膜移植重建急性期严重烧伤眼表的临床研究 \[J\]. 中华眼科杂志， 2004， 40(2):97-100.
\[11\]KUBO M， SONODA Y， MURAMATSU R， et al. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantatipn \[J\]. Invest Ophthamol Vis Sci， 2001， 42(7):1539-1546.
\[12\]张琪，赵敏，胡柯，等. 异源性新鲜和保存羊膜移植后免疫相容性及组织学转归的比较研究 \[J\]. 中国修复重建外科杂志， 2008， 22(5):619-624.
\[13\]KOIZUMI N， INATOMI T， QUANTOCK AJ， et al. Amniotic membrane as a substrate for cultivating limbal corneal epithelial cells for autologous transplantation in rabbits \[J\]. Cornea， 2000， 19(1):65-71.
\[14\]王峰，杜新华，常青. 新鲜羊膜移植对兔角膜碱烧伤房水中TNF-α的影响 \[J\]. 眼科新进展， 2006， 26(6):425-427.
\[15\]李立，汤永强，郭华兰. 兔眼前段碱烧伤后房水细胞因子和一氧化氮在眼内炎症反应中的作用 \[J\]. 重庆医科大学学报， 2004， 29(4):480-485.