【摘要】 目的检测乳腺癌组织中环氧化酶-2(COX-2)与血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达，探讨其与乳腺癌淋巴结转移之间的相关性及其意义。方法应用免疫组化SP法，检测60例乳腺浸润性导管癌组织及15例乳腺纤维腺瘤组织中COX-2及VEGF-C蛋白的表达情况。 结果乳腺癌组COX-2、VEGF-C表达的阳性率及表达程度均高于纤维腺瘤组(P<0.01);二者的表达均与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(P<0.01);二者在乳腺癌中的表达呈正相关(P<0.01);二者联合表达与乳腺癌淋巴结转移有关(P<0.05)。结论COX-2和VEGF-C在乳腺癌组织中呈过表达，且二者表达呈正相关，二者联合表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关;联合检测COX-2与VEGF-C在乳腺癌中的表达可以为临床制定合理的治疗方案提供参考依据。
【关键词】 乳腺癌;环氧化酶-2;血管内皮生长因子C;淋巴结转移
ABSTRACT: ObjectiveTo detect the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) in breast cancer and get further understanding of the correlation between these two indexes and lymph node metastasis of breast cancer.MethodsImmunohistochemical SP method was adopted in detecting COX-2 and VEGF-C protein expression in 60 cases of invasive ductal carcinoma and 15 cases of breast fibroadenoma.ResultsThe positive rate and expression level of COX-2 and VEGF-C in breast cancer were higher than those in fibroadenoma group (P<0.01). COX-2 and VEGF-Cs expression was positively correlated with lymph node metastasis in breast cancer (P<0.01)， and expressions of COX-2 and VEGF-C were positively correlated with each other. The co-expression of COX-2 and VEGF-C was related to lymph node metastasis(P<0.05).ConclusionCOX-2 and VEGF-C are over-expressed in breast cancer， and their expressions have a positive correlation. The co-expression of COX-2 and VEGF-C is related to lymph node metastasis. A join-detection of COX-2 and VEGF-Cs expression in breast cancer can provide a reference for instituting clinical treatment plan.
KEY WORDS: breast cancer;cyclooxygenase-2; vascular endothelial growth factor C; lymph node metastasis
乳腺癌是全世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。经淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径，淋巴结受累程度是决定乳腺癌分期及选择治疗方案、判断预后的关键因素之一。检测与淋巴结转移有关因素的表达对乳腺癌转移和预后有一定预测价值。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2， COX-2)是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，在乳腺癌、胃肠道肿瘤等多种肿瘤中呈过度表达。研究发现，COX-2可能通过上调血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C， VEGF-C)的表达而参与肿瘤新生血管的形成，利用抗VEGF及其受体的特异性单克隆抗体，可阻断VEGF诱发的血管及淋巴管内皮细胞的信号传导，抑制肿瘤血管、淋巴管的形成和经血液及淋巴道转移。本研究通过检测乳腺癌组织中COX-2及VEGF-C表达，探讨其与淋巴结转移的关系。
1材料与方法
1.1标本来源收集西安交通大学医学院第一附属医院2006年3月～2007年5月间手术切除的乳腺非特异性浸润性导管癌标本60例为研究对象，其中有腋淋巴结转移的30例，无腋淋巴结转移的30例;肿块长径≤2cm 23例，>2cm且≤5cm 30例，>5cm 7例。按WHO乳腺浸润性导管癌病理学分级标准，Ⅰ级19例，Ⅱ级18例，Ⅲ级23例。所有患者均为女性，年龄29～70岁，平均(45.21±8.23)岁，术前均未接受放疗、化疗等其他治疗，未合并其他系统恶性肿瘤，均行乳腺癌改良根治术，清除淋巴结数目均大于10枚。取门诊乳腺纤维腺瘤手术标本15例作为对照。
1.2主要试剂鼠抗人COX-2、VEGF-C单克隆抗体及SP试剂盒均购自中山生物技术有限公司。
1.3检测方法采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学染色方法(SP法)，操作在室温下进行。切片常规脱蜡脱水，微波抗原修复，3mL/L双氧水孵育，正常山羊血清室温孵育30min;分别滴加鼠抗人COX-2、VEGF-C单克隆抗体50μL，4℃过夜;滴加生物素标记二抗40～50μL，37℃孵育15min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min;DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，树胶封片。每批免疫组化染色均采用PBS稀释液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性的结肠组织切片作阳性对照。
1.4结果判断结果判定标准根据SHIMIZU法[1]改良而成：显微镜下细胞质显示棕黄色颗粒视为阳性着色。结合着色范围和着色强度，对图片进行半定量处理。①着色范围积分：在显微镜下(×200)随机选取5个视野，以阳性染色细胞占视野中所有细胞的百分比均值作为着色范围：≤1%为0分，2%～20%为1分，21%～50%为2分，≥51%为3分。②着色强度积分：无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分。上述两项积分相乘之积为范围强度积分：≤1.9为阴性(-)，2～2.9为弱阳性(+)，3～3.9为阳性()，≥4为强阳性()。
1.5统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件行统计学处理。数值均以均数±标准差(±s)表示，计数资料比较使用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料使用t检验，采用Spearman法进行相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1COX-2蛋白的表达情况
2.1.1两组COX-2蛋白阳性表达率的比较
COX-2主要表达于乳腺癌癌细胞的胞质中，呈淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色。60例乳腺癌组织中，COX-2的阳性率为73.3%(44/60)，明显高于对照组的20.0%(3/15)，差异具有统计学意义(χ2=14.590，P<0.01)。2.1.2COX-2表达与乳腺癌淋巴结转移的关系乳腺癌淋巴结转移组COX-2表达阳性率明显高于淋巴结无转移组，差异有统计学意义(χ2=5.455，P<0.05，表1、图1)。表1COX-2表达与乳腺癌淋巴结转移的关系
2.1.3COX-2蛋白表达程度的比较乳腺癌组COX-2蛋白表达程度明显高于对照组(P<0.01，表2)。乳腺癌淋巴结转移组COX-2蛋白表达程度积分值高于淋巴结无转移组，差异具有统计学意义(P<0.01，表3)。经Spearman秩相关分析，COX-2表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.480，P<0.01)。
2.2VEGF-C蛋白的表达情况
2.2.1两组VEGF-C蛋白阳性表达率的比较VEGF-C主要表达于乳腺癌癌细胞的胞质中，呈淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色。乳腺癌组VEGF-C表达阳性率为71.7%(43/60)，明显高于对照组的13.3%(2/15)，差异具有统计学意义(P<0.01)。
2.2.2VEGF-C表达与乳腺癌淋巴结转移的关系乳腺癌淋巴结转移组VEGF-C表达的阳性率明显高于淋巴结无转移组，差异有统计学意义(P<0.05，表4、图2)。表2乳腺癌组与对照组COX-2蛋白表达程度积分值的比较表3乳腺癌组不同淋巴结转移状态COX-2蛋白表达程度积分值的比较表4VEGF-C表达与乳腺癌淋巴结转移的关系
2.2.3VEGF-C蛋白表达程度的比较
乳腺癌组VEGF-C蛋白的表达程度明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01，表5)。乳腺癌淋巴结转移组VEGF-C蛋白表达程度积分值高于淋巴结无转移组，差异具有统计学意义(P<0.01，表6)。经Spearman图2乳腺癌组织中VEGF-C蛋白的表达情况Fig.2 The expression of VEGF-C in breast cancer (SP， ×200)A：淋巴结转移组;B：淋巴结无转移组。秩相关分析，VEGF-C表达与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(r=0.512，P<0.01)。表5乳腺癌组与对照组VEGF-C蛋白表达程度积分值的比较表6乳腺癌组不同淋巴结转移状态VEGF-C蛋白表达程度积分值的比较
2.3乳腺癌中COX-2与VEGF-C蛋白联合表达的分析
2.3.1COX-2与VEGF-C蛋白表达的关系经Spearman相关分析，乳腺癌组COX-2与VEGF-C表达呈正相关关系(r=0.582)。
2.3.2COX-2与VEGF-C联合表达与乳腺癌淋巴结转移的关系
COX-2及VEGF-C均阳性组淋巴转移发生率(76.7%)明显高于COX-2及VEGF-C均阴性组(6.7%)，差异有统计学意义(χ2=6.481，P<0.05，表7)。表7乳腺癌中COX-2与VEGF-C联合表达与淋巴结转移的关系
3讨论
COX是一种膜结合型的含有血红素的蛋白，是催化花生四烯酸(arachidonic acid， AA)转化成为前列腺素(prostaglandin， PG)和血栓素(thromboxane， TX)的限速酶[2]。目前已识别出COX的3种同工酶：COX-1、COX-2和COX-3。COX-2是诱导型酶，正常生理状态下在大多数组织中表达极低或不表达，但是它可以被许多刺激因素所诱导而发生高表达，因而可作为对包括肿瘤在内的多种疾病进行治疗性干预的良好靶点。COX-2已被报道表达于包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌等在内的多种恶性肿瘤中，而应用COX-2抑制剂有助于肿瘤的预防和治疗，而研究COX-2与恶性肿瘤的关系具有重要的临床意义[3]。
VEGF又名血管通透因子或血管调理素，具有促进细胞有丝分裂，防止内皮细胞凋亡、诱导血管生成、增加微血管通透性等作用。VEGF-C具有诱导淋巴管生成及血管生成的双重作用。研究证实，多种人类肿瘤组织如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌等中VEGF-C表达均增高，且VEGF-C表达上调与这些肿瘤的淋巴结转移密切相关，因而，VEGF-C已成为研究肿瘤生长及淋巴转移的新途径。
本实验检测了60例乳腺癌及15例乳腺纤维腺瘤中COX-2及VEGF-C的表达，二者在乳腺癌组织中表达率及表达程度均明显高于乳腺纤维腺瘤(P<0.01)，证实二者在乳腺癌中的表达明显高于乳腺良性疾病。本结果与之前的报道相符。
关于COX-2和VEGF-C的表达与乳腺癌淋巴结转移的关系，DENKERT等[4]研究发现，乳腺癌组织中COX-2的表达与淋巴结转移相关;亦有文献显示，VEGF-C通过促进淋巴管内皮细胞增生，使淋巴管数目增多，增大瘤细胞与淋巴管内皮的接触面积与淋巴管的通透性，改变淋巴管内皮黏附特性或表面趋化因子的表达，从而促进肿瘤转移[5]。本研究结果表明，COX-2与VEGF-C表达与乳腺癌淋巴结转移相关，淋巴结转移组COX-2及VEGF-C表达率明显高于淋巴结无转移组(P<0.05)，与前人的研究结果相符。乳腺癌淋巴结转移组COX-2及VEGF-C蛋白表达程度积分值亦明显高于淋巴结无转移组(P<0.01)。二者表达均与乳腺癌淋巴结转移呈正相关(P<0.01)，提示二者均在乳腺癌淋巴结转移过程中起一定作用。
研究表明，COX-2可通过上调VEGF-C的表达诱导淋巴管内皮细胞增殖，从而促进胚胎及肿瘤中淋巴管的生成及淋巴网络的形成，最终导致肿瘤细胞经淋巴转移[6]。COX-2可以通过EP1/SRC/HER-2/NEu途径促进VEGF-C的高表达，从而促进淋巴管的形成[7]。实验已证明，COX-2基因敲除的小鼠比野生型小鼠瘤体内血管密度低30%[8]，体外COX-2基因转染或高表达的肿瘤细胞对凋亡的抵抗能力、血管形成因子的生成能力、转移能力及促血管内皮细胞迁移能力均增强，而且与肿瘤生长及血管生成有关的多种因子表达都明显增强[9]，而COX-2抑制剂则可抑制VEGF的表达，降低微血管密度[10]。
本研究结果显示，COX-2阳性表达组中VEGF-C的表达率明显高于COX-2阴性组;COX-2与VEGF-C在乳腺癌中的表达呈正相关，且COX-2及VEGF-C联合表达与乳腺癌淋巴结转移有关，即COX-2及VEGF-C均阳性组淋巴转移发生率明显高于COX-2及VEGF-C均阴性组。提示COX-2及VEGF-C在乳腺癌淋巴结转移过程中可能有一定的协同作用，VEGF可能是COX-2影响淋巴结转移的一个重要介质，COX-2通过调节VEGF而参与了促进乳腺癌的发展和转归。联合检测COX-2与VEGF-C在乳腺癌中的表达有助于判断乳腺癌的发展状态并制定合理的治疗方案。
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