作者：种铁，付德来，牛建强，李和程，张鹏，甘为民，王子明
【摘要】 目的观察苦参碱对体外培养的人ACHN肾癌细胞的生长抑制作用，并探讨其可能的作用机制。方法应用不同浓度的苦参碱分别作用于人肾癌ACHN细胞株24、48、72、96h，采用MTT 法观察苦参碱对ACHN的细胞毒作用;透射电镜和流式细胞术检测苦参碱对ACHN细胞凋亡的影响;免疫细胞化学技术检测苦参碱对ACHN细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果不同浓度的苦参碱对ACHN细胞株均有一定的增殖抑制作用，且呈量效和时效关系;苦参碱能明显诱导ACHN细胞株凋亡;苦参碱作用后，ACHN细胞株Bax蛋白表达明显增强，Bcl-2蛋白表达有下降趋势，但无统计学差异。结论苦参碱对体外培养的人肾癌ACHN细胞株有显著的增殖抑制作用，其机制可能与调节Bcl-2/Bax蛋白表达比值、诱导细胞凋亡有关。
【关键词】 苦参碱;肾癌;ACHN细胞株
ABSTRACT: ObjectiveTo observe matrines inhibitory effect on the growth of ACHN human renal cell carcinoma in vitro and explore its possible mechanism.MethodsThe cell line of ACHN human renal cell carcinoma was treated with matrine of different concentrations for 24， 48， 72 and 96h， respectively. MTT assay was used to evaluate the cytotoxic effects of matrine on ACHN cells. The ACHN cell apoptosis induced by matrine was detected with transmission electron microscopy and flow cytometry. The expressions of Bcl-2 and Bax proteins were evaluated with immunocytochemical technique.ResultsMatrine of different concentrations had a cytotoxic effect on ACHN cell line in obvious dose- and time-dependent manners. Matrine could obviously induce apoptosis of ACHN cell line. Bax protein expression was significantly increased while the expression of Bcl-2 protein declined but with no significant difference. ConclusionMatrine has an obvious inhibitory effect on proliferation of ACHN renal cell carcinoma in vitro， which may be related to down-regulating the ratio of Bcl-2/ Bax protein expression and promoting cell apoptosis.
KEY WORDS: matrine; renal cell carcinoma; ACHN cell line
肾细胞癌(renal cell carcinoma， RCC)约占成年人全部恶性肿瘤的2%～3%、占肾脏肿瘤的90%～95%[1]，且近年来发病率逐渐上升，全球每年新发病例约为209000例、死亡病例102000例[2]。我国肾癌在泌尿生殖系统肿瘤中的发病率仅次于膀胱癌。局限性肾癌可以通过根治性肾切除术治疗，然而在肾癌诊断时约有1/3的患者已出现转移[3]，另外局限性肾癌手术治疗后仍有30%～40%发生远处转移。目前，进展期肾癌尚缺乏有效的治疗方法，探索肾癌新的治疗方法已成为泌尿外科医师面临的重要课题。
苦参碱(matrine， Ma)是从传统中药苦参、苦豆子中提取的生物碱(图1)，目前临床上广泛用于慢性病毒性肝炎的治疗[4-5]。近年研究发现，苦参碱对肺癌[6]、肝癌[6-7]、乳腺癌[8]、胃癌[9]等多种肿瘤的生长均表现出抑制作用。我们前期研究亦发现，苦参碱对体外培养的人肾颗粒细胞癌GRC-1[10]、透明细胞癌786-O[11]细胞株具有显著的生长抑制作用。本研究拟应用不同浓度的苦参碱作用于人肾癌ACHN细胞系，进一步观察其对人肾透明细胞癌的生长抑制作用。图1苦参碱的结构Fig.1 Structure of matrine
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人肾颗粒细胞癌ACHN 细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，在常规37℃、50mL/L CO2及完全饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.1.2主要试剂苦参碱由西安鸿生生物技术有限公司惠赠，纯度>98%;优级新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司(批号No.2008517);RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司(批号No.1285082);膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-fluorescein isot hiocyanate/propidiumiodide， Annexin Ⅴ-FITC/PI)双标记染色试剂购自深圳晶美生物工程有限公司(批号No.20080610);Bcl-2抗体(批号No.10205)和Bax抗体(批号No.H0105)均为美国Santa Cruz公司产品;链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-biotin-peroxidase method， SP)鼠二抗试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司(批号No.51182001)。
1.1.3主要仪器POLARstar OPTIMA 多功能微板测试系统购自德国BMG LAB TEC公司;FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司;PB2032N电子微量天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.2方法
1.2.1MTT法测定苦参碱对ACHN细胞株增殖的影响取对数期ACHN细胞悬液100μL(5×103个)，加入96孔板(美国Corning Costar公司)，加入苦参碱，使其终质量浓度分别达到0.3、0.5、0.8、1.0、1.5g/L，同时另设调零孔和阴性对照孔。每组设5个复孔。作用24、48、72、96h后，每孔分别加入5g/L MTT 20μL，37℃孵育4h，弃上清。加入150μL二甲亚砜，平板摇床微振荡20min。POLARstar OPTIMA多功能微板测试系统测量490nm各孔的吸光度(A)，每孔重复测量3次。按照公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率(%)=[1-(A苦参碱组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)]×100%。
1.2.2倒置光镜和透射电镜下观察苦参碱作用后ACHN细胞的形态结构对数期贴壁生长的ACHN细胞，分别用0.5、1.0、1.5g/L苦参碱作用72h，在倒置显微镜下观察，并应用图像采集系统采集图像并分组保存。上述细胞观察完毕，胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀的细胞用4℃预冷的30mL/L戊二醛固定2h，PBS液冲洗，10mL/L锇酸固定1h，丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，制成超薄切片铜网，经醋酸铀、枸橼酸铅染色后在透射电镜下进行观察。以不加苦参碱培养72h的ACHN细胞株作为空白对照组。
1.2.3流式细胞术检测苦参碱作用后ACHN细胞的凋亡情况参照张德杰等[12]文献报道。6孔板中加入细胞悬液，12h后细胞完全贴壁。将1号孔设为阴性对照，于2、3、4号孔内加入苦参碱使终浓度分别达0.5、1.0、1.5g/L，作用12h后用胰酶消化，吹打脱落，PBS液洗涤，1500r/min离心5min，弃上清，加缓冲液200μL，取100μL作为参照。各管中分别加入Annexin V-FITC/PI，避光放置30min，用FACSCalibur流式细胞仪进行检测分析。
1.2.4免疫细胞化学法检测ACHN细胞株Bcl-2/Bax蛋白的表达将无菌盖玻片置于6孔板内，加入细胞悬液，培养24h，细胞贴壁生长于玻片后，加入苦参碱使终浓度达到1.5g/L;另设不加苦参碱的空白对照组。作用12h 后，用900mL/L乙醇固定玻片15min。SP法按试剂盒说明书进行操作。PBS液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。Motic Med 6.0数码医学图像分析系统(A)分析免疫细胞化学结果。每组3张细胞爬片，每张随机选取2个视野采集图象，取其平均值。应用灰度值反映染色强度，染色强、蛋白表达高，灰度值小;染色弱、蛋白表达低，灰度值大。
1.2.5统计学分析所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料均数用±s表示，采用析因设计的方差分析，两样本均数比较采用成组t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1苦参碱对ACHN细胞增殖的抑制作用
MTT结果显示，加入0.3、0.5、0.8、1.0、1.5g/L苦参碱的ACHN细胞，培养24、48和72h后，细胞生长抑制率随苦参碱浓度的增高、作用时间的延长而升高(表1、图2)。
2.2苦参碱作用后ACHN细胞形态结构的变化
倒置显微镜下可见，正常培养的ACHN细胞呈单层生长，细胞排列密集，形态不规则，细胞体积较大，胞质透明，核小、位于细胞中央;苦参碱作用72h后，细胞体积变小，排列稀疏，胞质透亮度下降;1.5g/L苦参碱组见细胞密度明显降低，细胞形态趋于一致，呈圆形，核分裂相少见(图3)。 表1不同浓度苦参碱作用不同时间后ACHN细胞的生长抑制率图2苦参碱作用后ACHN细胞生长抑制率的变化Fig.2 Growth-inhibiting effect of matrine on ACHN cell lineA：细胞生长抑制率与苦参碱作用时间的关系;B：细胞生长抑制率与苦参碱药物浓度的关系。图3苦参碱作用72h ACHN细胞的光镜下形态Fig.3 Micromorphology of ACHN cells after 72hs administration of matrine A：对照组;B：0.5g/L苦参碱组;C：1.0g/L苦参碱组;D：1.5g/L苦参碱组。透射电镜观察发现，对照组胞质内细胞器丰富，线粒体体积较小，内质网不多，核糖体丰富，未见凋亡细胞及凋亡小体(图4A);苦参碱作用72h后细胞出现细胞质空泡样，染色质高度浓集，核固缩(图4B)。
2.3苦参碱对ACHN细胞凋亡的影响
苦参碱作用24h后，0.5、1.0、1.5g/L参碱组细胞凋亡率分别为(14.68±3.47)%、(19.07±2.31)%、(32.29±4.51)%。与对照组[(8.20±3.1)%]相比，1.0、1.5g/L剂量组均表现出统计学差异(P<0.05，图5)。图4苦参碱作用前、后ACHN细胞的超微结构Fig. 4 Ultrastructure of ACHN cells after matrine administration (×3000)A：对照组，箭头示正常细胞核;B：1.0g/L苦参碱组，箭头示固缩的细胞核。
2.4苦参碱对ACHN细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响免疫细胞化学染色后，应用图像分析显示：对照组Bcl-2的灰度值为(149.55±6.49)，Bax的灰度值为(162.52±14.50);1.5g/L苦参碱作用24h后，Bcl-2的灰度值为(151.84±8.32)，Bax的灰度值为(132.97±13.87)(图6、图7)。统计分析发现，苦参碱作用后，Bax蛋白表达较对照组显著增强(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达有下调趋势，但与对照组相比缺乏统计学意义(P>0.05)。图5苦参碱作用后ACHN细胞的凋亡情况Fig.5 Effect of matrine on apoptosis of ACHN cell lineA：对照组;B：0.5g/L苦参碱组;C：1.0g/L苦参碱组;D：1.5g/L苦参碱组。图6ACHN细胞Bcl-2蛋白的免疫细胞化学染色Fig.6 Bcl-2 expression in ACHN cell line (immunocytochemical staining， ×400)A：对照组;B：1.5g/L苦参碱组。图7ACHN细胞Bax蛋白的免疫细胞化学染色Fig.7 Bax expression in ACHN cell line (immunocytochemical staining， ×400) A：对照组;B：1.5g/L苦参碱组。
3讨论
苦参碱对多种肿瘤均表现出较强的生长抑制作用。本实验MTT法观察发现，苦参碱作用后各组均出现不同程度的生长抑制现象，光镜下更是见到苦参碱作用后细胞生长密度降低，形态趋于圆形，这提示苦参碱对体外培养的人肾癌ACHN细胞具有显著的生长抑制作用。进一步纵向和横向比较发现，0.3、0.5、0.8、1.0、1.5g/L的苦参碱作用24、48、72h后，ACHN细胞生长抑制率随着苦参碱作用时间的延长、苦参碱浓度的增高逐渐增大，这提示苦参碱抑制ACHN细胞生长具有典型的时效性和量效性。这与苦参碱对肝癌、NCI-N87胃癌[13]及GRC-1肾癌[10]的观察一致。在作者的前期研究中，人肾颗粒细胞癌GRC-1细胞系在1.0g/L和1.5g/L苦参碱作用72h后，细胞生长抑制率分别为(29.2±9.5)%和(34.0±4.9)%，人肾透明细胞癌ACHN细胞系在同样浓度的苦参碱作用同样时间后，细胞生长抑制率分别达到(57.41±13.59)%和(75.94±12.34)%，显著高于GRC-1细胞系，这说明ACHN细胞系比GRC-1细胞系对苦参碱更敏感。这种敏感性的差异是否提示肾透明细胞癌较颗粒细胞癌对苦参碱更敏感，有待进一步研究。
本研究流式分析发现，苦参碱作用ACHN细胞凋亡比例较对照组显著增多，形态学观察也发现细胞质空泡样、染色质高度浓集、核固缩等典型的凋亡表现。提示苦参碱可诱导体外培养的人肾癌ACHN细胞株凋亡，从而抑制ACHN细胞增殖。这与我们前期在肾癌GRC-1细胞系中的研究结果一致[10]。
Bcl-2/Bax是Bcl-2基因家族中的重要成员。Bcl-2基因是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类[14]，一类具有抑制凋亡作用(如Bcl-2)，而另一类具有促进凋亡作用(如Bax)。通常情况下，细胞内这两种蛋白的表达量处于相对的稳态，当细胞受到凋亡信号的刺激时，促凋亡蛋白表达量增加，促凋亡与促生存蛋白之间的平衡被打破，细胞就会走向凋亡[15-16]。本研究发现，1.5g/L苦参碱作用24h后，ACHN细胞株Bax蛋白表达较对照组显著增强(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达有下调趋势，但与对照组相比缺乏统计学差异，提示苦参碱诱导ACHN细胞株凋亡可能与Bcl-2/Bax蛋白表达比值下降相关。这与苦参碱在肾癌GRC-1细胞系[10]、胃癌NCI-N87细胞系[13]、肝癌HepG2细胞系[17]中的研究结果类似。
综上，本研究发现苦参碱对体外培养的人肾癌ACHN细胞系具有显著的生长抑制作用，这可能与其通过调整Bcl/Bax比例、诱导细胞凋亡有关。苦参碱在动物体内对肾癌模型的作用如何，还需进一步研究。
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