生后早期大鼠视皮层锥体神经元的电学特性

　　　　 作者：孟凯，李延海，谢雯，张莉，李萍，韩太真

【摘要】 目的 观察生后早期大鼠视皮层Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元的电学特性。方法 采用膜片钳全细胞记录结合显微镜直视细胞技术，在急性分离的大鼠视皮层脑片标本上，探讨生后早期大鼠视皮层Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元的被动和主动电学特性以及动作电位(AP)的发放特征。结果 生后11～13d(P 11～13)大鼠锥体神经元静息电位为(-56.6±1.8)mV，输入阻抗为(185.4±2.7)MΩ，膜电容为(77.9±2.2)pF，时间常数为(16.9±2.4)ms。AP的幅值和时程分别为(97.7±2.7)mV和(2.3±0.1)ms，阈电位为(-31.8±1.4)mV，后超极化电位为(-65.3±1.3)mV。在受到长的强度不变的去极化电流时，多数神经元表现出明显的锋电位频率适应。AP发放时其稳定放电频率约为第1个放电频率的(30.4±9.4)%。　结论 P 11～13大鼠视皮层的锥体神经元的电学特性与成年大鼠不完全相同，大多数的神经元表现出规则放电形式，但其放电频率的适应程度较小。

【关键词】 电学特性;大鼠;视皮层;膜片钳

　　ABSTRACT: Objective To investigate the electrophysiological properties of layer Ⅱ/Ⅲ pyramidal neurons of the early postnatal stage rat visual cortex.Methods By using the whole cell patchclamp recording technique combined with direct visualization of cells， we studied the passive and active electrophysiological properties as well as firing properties of layer Ⅱ/Ⅲ pyramidal neurons in acute rat visual cortical slices.Results Resting membrane potential， input resistance， membrane capacitance and membrane time constant of pyramidal neurons at postnatal days 11-13 (P 11-13) were (-56.6±1.8)mV， (185.4±2.7)MΩ， (77.9±2.2)pF and (16.9±2.4)ms， respectively. Action potential amplitude and duration were (97.7±2.7)mV and (2.3±0.1)ms， respectively. Threshold potential was (-31.8±1.2)mV and afterdepolarizing potential was (-65.3±1.1)mV. When presented with long depolarizing current pulse of constant amplitude， most of the neurons exhibited pronounced adaptation of spike frequency. The steadystate firing frequency was (30.4±9.4)% of the first interval firing frequency.Conclusion The electrophysiological properties of layer Ⅱ/Ⅲ pyramidal neurons of the early postnatal stage rat visual cortex are not fully mature. Most of the neurons display regular firing patterns， but the degree of firing frequency adaptation is relatively small.

　　KEY WORDS: electrophysiological properties; rat; visual cortex; patch clamp

　　锥体神经元是皮层的投射神经元，它发出的轴突投射皮层及皮层下区域，具有远距离传送信息的功能;而非锥体神经元主要在皮层内形成局部回路。了解新皮层神经元的电学特性是认识神经元在神经网络中的作用和功能的关键要素[1]。神经元的电学特性，不仅显著影响神经元的输入输出关系(inputoutput relationships)及神经元和神经回路的活动[2]，而且可作为判定神经元种类的标准。不同脑区皮层锥体神经元的电学特性不完全相同，一般而言，在受到较长时间的刺激时，其动作电位(action potential， AP)的发放有适应性，即为规则放电(regular spiking)，但不同的神经元其频率的适应程度、AP的特性、后超极化电位(afterdepolarizing potential， AHP)的大小及持续时间等则有较大的差异[3]。此外，神经元的内在膜特性还能反映出神经元的成熟状态，因而它们又可作为评估神经元成熟程度的重要指标之一[4]。资料显示，生后前10d内神经元电学特性变化最大，在生后的前两周内，神经元电学特性随发育变化很快，到第3周末接近成年时的水平[58]。之前有关视皮层Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元电生理特性的研究资料，主要是采用常规细胞内记录方法获得的，如1990年MASON等[9]采用此方法探讨了成年大鼠视皮层Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元的电学特性，至今仍作为重要的参考资料。本研究中，我们采用膜片钳全细胞记录技术，在急性分离的大鼠视皮层脑片标本上，系统探讨了生后早期大鼠视皮层Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元的被动和主动电学特性，以及AP的发放特征。研究结果进一步丰富了锥体神经元的电生理学资料，为充分了解神经元功能及探讨该部位的突触可塑性提供背景性资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 实验选用西安交通大学医学院实验动物中心提供的健康SpragueDawley大鼠，鼠龄为生后11～13d(postnatal day 11～13， P 11～13)(大鼠出生日为P0)。动物在12/12h明/暗交替的环境中饲养。

　　1.2 视皮层脑片的制备与孵育 采用常规方法制备视皮层脑片标本[10]。大鼠用乙醚麻醉后，浸没在冰水中(暴露鼻孔)3min，以降低脑温度，待仅有微弱呼吸时取出。大鼠断头后，立即将大脑移出并放置于冰冷(1～4℃)的950mL/L O2和

　　50mL/L CO2饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid， ACSF)中。ACSF中含(单位mmol/L)：NaCl 124，KCl 5，Kh3PO4 1.25，MgSO4 1.3，CaCl2 2.4，NaHCO3 26，

　　葡萄糖10，其渗透压为305～310mOsm/kg h3O。用振动切片机(MA752，英国Campden公司)将含有视皮层的脑组织块切成400μm厚的脑片。将切好的脑片移至内有ACSF的自制的孵育槽内，并持续通950mL/L O2和50mL/L CO2的混合气体，室温下孵育。在电生理实验前，脑片孵育至少1.5h。

　　1.3 视皮层脑片的全细胞记录 将孵育后的脑片转移到灌流记录槽中，并放置自制的铂金盖网(用铂金丝弯成U形框架，在其上粘附几根细尼龙丝)于脑片上方以固定脑片的位置。使用蠕动泵持续向记录槽中灌注氧饱和的ACSF，灌流速度为2.5～3mL/min，使用温控仪将记录槽内灌流液温度维持于(31±0.5)℃。

　　使用奥林巴斯直立式红外微分干涉相差显微镜，确定脑区和选择细胞。首先，参照脑立体定位图谱[11]，在低倍物镜(×5)下找到大鼠初级视皮层单眼区(primary visual cortex， monocular area， V1M)的Ⅱ/Ⅲ层(图1)，然后在高倍浸水物镜(×40)下，通过红外摄像头在监视器上选择边界清楚、表明光滑且折光性强的锥体细胞，并在监视器屏幕上标记定位此细胞。使用微电极拉制仪

　　(P97，美国Sutter公司)拉制玻璃微电极作为记录电极，灌充电极内液后其电极阻抗为3～5MΩ。电极内液中含(单位mmol/L)：Kgluconate 135，KCl 5，MgCl2 2，CaCl2 0.1，EGTA 1，HEPES 10，Na2ATP 2，Na3GTP 0.25，其渗透压为280～290mOsm/kg h3O，用KOH将其pH调于7.3～7.4。将记录电极安置在微电极操纵仪的电机架上，在低倍物镜下调整微电极的位置。给予电极内一定的正压后将其浸入ACSF，下移微电极直至视皮层脑片上方后，转换低倍物镜为高倍物镜，补偿电极直流电位，继续下压电极至目的细胞上方，待细胞表面出现一小凹，立即撤除正压并给予短暂的负压，借助钳制电位水平(-70mV)可获得高阻抗(>1GΩ)封接。成功封接后补偿电极电容，施加负压或/和ZAP电脉冲，穿破微电极尖端内的细胞膜，使细胞内液与电极内液相通，建立全细胞记录模式。采用电压钳、电流钳记录模式，利用Axoclamp 700B放大器分别将细胞的膜电位或膜电流钳制在设定水平上，模数-数模转换器(Digidata 1322A)采样频率为10kHz，低通滤波频率为2kHz，未补偿串联阻抗。数据的采集和分析均使用Axon公司提供的软件包pCLAMP 9.2。用于分析的实验数据标准为串联阻抗小于20MΩ，其变化不大于10%。

　　1.4 神经元电学特性的观测 神经元电学特性是在全细胞记录模式稳定至少3min后测量。在电压钳模式下，将细胞的膜电位钳制在-70mV，同时给予细胞去极化步进电压指令，使用Clampex 9.2软件中的膜测试功能(membrane test)，可以直接测出细胞膜的部分被动电学特性，包括输入阻抗(input resistance， Rin)和膜电容(membrane capacitance， Cm)[12]。在电流钳模式下，将钳制电流设置为0pA，此时的膜电位即为静息电位(resting potential， RP)，在此模式下继续观测神经元膜的电学特性。在由注入持续时间为1000ms、幅值为40pA的超极化电流诱导的电压反应中测量膜时间常数(membrane time constant， τ)[13]。为了研究AP的特性，注入持续时间为4ms的去极化步进电流以诱导产生单个动作电位，参照文献[1314]观测阈电位(threshold potential， TP)、AP的幅值和时程、AHP等。给神经元注入持续时间为

　　1000ms的去极化步进电流，探讨神经元的放电特征。神经元的瞬间放电频率(instantaneous firing frequency)为串动作电位中相邻锋电位时间间隔的倒数，AP放电频率适应(firing frequency adaptation)的程度用稳定放电频率占第1个放电频率的百分比来衡量[14]。

　　1.5 数据分析 所有分析的神经元需满足以下条件：①RP的绝对值大于50mV;②AP的阈电位值比RP值低10mV以上;③AP的超射值在0mV以上[9]。使用pCLAMP 9.2软件包中的Clampfit 9.2分析和处理符合要求的数据。数据用均数±标准误(mean±standard error of the mean， mean±s)表示。

　　2 结 果

　　采用膜片钳全细胞记录技术，结合红外可视显微镜直视细胞的方法，共探讨了12只P11～13大鼠V1M Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元的电学特性。所有观察神经元的放电型式均符合锥体神经元的特征，表明均为锥体神经元。记录的所有神经元RP绝对值均大于50mV，且在RP水平均无自发放电活动。

　　电流钳模式下，钳制膜电流为0pA，膜电位在RP基础上，通过给神经元注入持续时间为4ms的去极化步进电流以诱导并探讨了锥体神经元AP的特性(图2A)。所有观测神经元AP的后电位均主要由后去极化电位(afterdepolarizing potential， ADP)和一个AHP组成，在ADP前均未见明显的快AHP(fast AHP， fAHP)(图2A)。τ如图2B所示。

　　图2 大鼠锥体神经元的动作电位和局部电位

　　Fig.2 Action potential (AP) and local potential in a pyramidal neuron

　　A：P12大鼠上短时程去极化电流诱导的AP。上：原始记录曲线显示了锥体神经元对注入的去极化电流所做出的电压反应;下：注入的去极化电流。锋电位后紧跟随一个后去极化电位和一个后超极化电位(箭头所示)。B：长持续40pA超极化电流诱导的局部超极化电位。箭头所示为膜时间常数τ。

　　与成年大鼠相比[9]，P11～13大鼠Ⅱ/Ⅲ层锥体神经元的Rin较大，τ较长，AP的幅度较小，阈电位较大;AP的时程较长。提示其电学特性尚未完全发育成熟(表1)。

　　注入1000ms的步进去极化电流后，在P11～13大鼠V1M锥体神经元可观察到AP的频率性发放，在一定范围内，第一个AP的潜伏期随注入去极化电流强度的增加而缩短;AP发放的个数和频率随注入的去极化电流强度的增加而增加(图3)。表1 生后11～13d大鼠视皮层锥体神经元的电学特性

　　A、B、C：分别为注入递增的电流依次在锥体神经元上诱导的动作电位。RP为-62mV。箭头所示为后超极化电位。D：向细胞内注入的步进去极化电流。

　　当给神经元注入1000ms、160pA的去极化电流时，约83%(10/12)产生规则放电。这些神经元在产生频率发放时，每个AP后均跟随一个中等AHP(medium AHP， mAHP)(图4A)。神经元放电时，其平均放电频率的变化如图4B所示，在长的去极化电流刺激时，神经元产生的AP的发放频率逐渐降低，在第9个AP后能达到相对稳定水平，即表现出规则放电模式，又称为放电的频率适应。根据文献报道[9]，我们采用第9个AP的放电频率占第1个AP的放电频率的百分比来衡量神经元放电频率的适应程度，P11～13大鼠V1M锥体神经元放电频率的适应程度约为第1个放电频率的(30.4±9.4)%。

　　除规则放电外，有些锥体神经元可具有特殊的放电型式。研究发现，即使注入较大的去极化电流，有2个P11～13大鼠的锥体神经元仅产生1个或少数几个AP，而没有出现频率性发放。图5为一典型的这类神经元的放电型式。而这些神经元的其他电学特性，如Rin、RP、AP等，与同年龄组的其他神经元基本相同。提示，这种放电模式并非由于受损伤所致。

　　A：在RP基础上1000ms，160pA的去极化电流(下图)在P12大鼠1个神经元上诱导的串动作电位(上图);B：P11～13大鼠串动作电位中每个动作电位的平均即刻放电频率与动作电位序列的关系图(n=10，mean±s)。

　　A、B、C：分别为注入递增的电流依次在P11大鼠的视皮层Ⅱ层浅层诱导的动作电位。RP为-53mV。D：向细胞内注入的步进去极化电流。

　　3 讨 论

　　神经元电学特性的最初研究是在整体动物标本上进行的，随后，培养或急性分离的细胞、离体脑片标本等也被广泛应用。自上个世纪80年代初，脑片标本开始应用以来，因为其具有整体动物或单细胞所不具备的优点，因此在细胞电学特性的研究中得到越来越多的应用，提供了更多的实验资料。在保留了神经元局部回路联系的基础上，脑片标本在研究电学特性方面至少具有以下优点：在显微镜直视下，根据形态和大小可选择所感兴趣的神经元;易于改变细胞内、外液中离子的成分或浓度，施加离子通道的或受体的拮抗剂、激动剂等;易于对各年龄组，尤其是对生后早期发育的神经系统进行研究[1]。当然，整体动物标本中，神经元的活动更接近自然情况，即有更多突触活动和神经调节可影响其活动。由于其显著的优点，当今国际上越来越多采用脑片膜片钳方法研究神经细胞的电生理学和形态学的特点[15]。此技术应用于视皮层Ⅱ/Ⅲ的研究报道不多，特别缺乏对于动物处于视觉发育过程中的研究。由于幼年动物颅骨较软，不易进行脑的固定与立体定位，因此选用整体动物研究神经系统的发育较困难，而脑片标本在研究发育的生理及药理学特性方面有很多优点。为此本研究采用脑片膜片钳方法探讨了生后早期视皮层神经元的电生理学特性。

　　本研究发现，给P11～13大鼠V1M锥体神经元注入强度不变的长持续去极化电流，其AP的发放出现适应现象，这种形式的放电为规则放电。规则放电模式是皮层锥体神经元放电的共有特征[3]。规则放电形式是1969年MOUNTCASTLE等[16]首先在猴的皮层采用细胞外记录方法发现并命名的。随后，MCCORMICK等[17]采用细胞内记录的方法也发现了这种放电形式，并证实其主要为锥体神经元的放电形式。AP的发放出现适应现象的机制较复杂，目前认为主要与mAHP和内向整流电流(IH)有关。mAHP的产生主要是Ca2+依赖的K+电流介导，它通过控制神经元即刻放电频率而使得AP的发放出现适应现象[18]。

　　IH主要由Na+ 和K+介导，其反转电位(reversal potential)为-50mV。在膜电位为-55mV时它可被激活而且电流较大，因此，它可影响AHP的形状，减小锋电位的间隔时间，增加放电频率[1]。

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