线粒体途径在脱氧胆酸诱导食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用

　　　　 作者：吴建涛，徐天娇，龚均，王进海，董蕾

【摘要】 目的 观察线粒体途径在脱氧胆酸(deoxycholate， DCA)诱导体外培养的人正常食管黏膜上皮细胞凋亡中的作用。方法 采用无血清的角朊细胞培养基体外培养人正常食管黏膜上皮细胞，采用流式细胞仪检测Rh123和/PI的荧光强度，分析线粒体跨膜电位(ΔΨm)的变化情况;蛋白免疫印迹法检测细胞色素c(Cyt.c)、Caspase3和多聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)的表达及抑制剂对细胞凋亡和Caspase3活化的影响。结果 食管黏膜上皮细胞用100μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞在对照组为(1.8±0.6)%，48h为(30.5±1.7)%;用200μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞36h可达(43.1±0.2)%(P<0.05)。PI阴性但Rh123低染细胞开始出现，并逐渐增加，DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下降，表明凋亡细胞在逐渐增多。Cyt.c和活化的Caspase3的抗体显示，随着线粒体ΔΨm的下降，Cyt.c、Caspase3酶原也被剪切活化， Casapse3的底物PARP也发生了降解活化。Caspase3特异性抑制剂 DEVDFMK部分抑制了DCA诱导食管上皮细胞的凋亡，但对线粒体跨膜电位的下降则没有影响。结论 DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡是通过线粒体途径引起的，线粒体、Caspase3、PARP的活化共同参与了DCA诱导食管黏膜上皮的凋亡过程。

【关键词】 脱氧胆酸;食管黏膜上皮细胞;线粒体途径;凋亡

　　ABSTRACT: Objective To study the role of mitochondrial pathway in deoxycholate (DCA)induced apoptosis of human normal esophageal mucosal epithelial cells.Methods Cultured normal human esophageal mucosal epithelial cells were treated with deoxycholate. We used flow cytometry to determine mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and its permeability. Expressions of caspase3， cytochrome c and poly (ADPribose) polymerase (PARP) were detected with Western blotting. Caspase3 inhibitor DEVDFMK was used to explore the role of caspase in deoxycholateinduced apoptosis of human normal esophageal epithelial cells.Results Esophageal epithelial cells treated with 100μmol/L of DCA， PInegative but low Rh123 stained cells in the control group (1.8±0.6)%， 48h was (30.5±1.7)%; after 200μmol/L of DCA treatment， PI negative but low Rh123 stained cells numbered up (43.1±0.2)% at 36h (P<0.05). PInegative but low Rh123 stained cells began to appear， and gradually increased， DCA induced apoptosis when the mitochondrial membrane potential decreased， indicating that apoptotic cells gradually increased. Cyt.c and activation of Caspase3 antibody showed that with the decline in ΔΨm of mitochondria， cleavage of Cyt.c， Caspase3 and poly (ADPribose) polymerase (PARP ) of Casapse3 substrate also occurred in the degradation activation. Caspase3 specific inhibitor DEVDFMK could partially inhibit the DCAinduced apoptosis of cells， but did not affect the decrease in mitochondrial membrane potential.　Conclusion DCA induces the apoptosis of esophageal mucosal epithelial cells through the mitochondrial pathway. Mitochondria， caspase3 and activation of PARP cleavage are also involved in the apoptosis.

　　KEY WORDS: deoxycholate; esophageal mucosal epithelial cell; mitochondrial pathway; apoptosis

　　近年来，十二指肠胃食管反流在胃食管反流病的发生发展过程中所起的作用越来越受到国内外学者的重视，尤其是十二指肠反流物中的胆酸在胃食管反流病及其并发症(反流性食管炎、Barretts食管以及食管癌)的发病中所起的作用及其对食道黏膜上皮细胞的损伤作用。在多种十二指肠反流物质中，胆酸被认为是较严重的损伤物质[1]，并且一些胆酸可诱导细胞凋亡造成食管上皮细胞损伤[24]。

　　线粒体途径是引起细胞凋亡的重要途径之一。线粒体的功能改变与细胞凋亡密切相关。许多因素，包括死亡受体介导的信号、促凋亡因子等，引起线粒体功能损伤可使线粒体跨膜电位(mitochondria membrane potential， ΔΨm)降低和线粒体通透性(mitochondria permeability transition， MPT)改变，使线粒体膜间隙存在的大量小分子蛋白物质释放出来，并由此引起促凋亡物质释放等一系列变化，包括细胞色素c(cytochrome c， Cyt.c)、多聚(ADP核糖)聚合酶[poly(ADPribose)polymerase， PARP]、Omi/HtrA2等细胞凋亡诱导因子，从而诱导半胱天冬肽酶依赖和非依赖性细胞凋亡[56]。

　　本课题的前期研究已经证实，胆酸(盐)能诱导食管黏膜上皮细胞凋亡[79]，但引起凋亡的通路尚不清楚。因此，本研究将探讨脱氧胆酸(deoxycholate， DCA)在诱导食管黏膜上皮细胞凋亡时线粒体膜通透性和膜电位在细胞凋亡中的作用，确定其是否通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 DCA购自Sigma公司;碘化丙碇、AnnexinⅤ检测试剂盒购自BD Biosciences公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;蛋白酶抑制剂及罗丹明(Rhodamine， Rh123)购自美国Sigma公司，罗丹明用三蒸水配成10μg/mL的储存液，4℃避光保存;Caspase3、PARP、Cyt.c、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自Cell Signaling Technology， Inc.;Caspase3特异抑制剂DEVDFMK购自美国Calbiochem公司，使用前溶解于DMSO并分装保存于-20℃;βactin的抗体购自江苏碧云天生物技术研究所。

　　1.2 细胞培养和处理 实验过程中，细胞以5×105细胞/mL的密度接种培养，经DCA按实验设计所需时间和浓度处理后，并在有/无Caspase3抑制剂50μmol/L DEVDFMK预处理的情况下与所需DCA一起进行孵育。

　　1.3 流式细胞仪检测线粒体跨膜电位 线粒体ΔΨm的检测按试剂盒说明书操作流程进行。实验分为对照组和实验组。大约5×105细胞/mL用100μmol/L、200μmol/L的DCA在不同时间段诱导食管细胞，收集细胞，PBS漂洗;10μg/mL的碘化丙碇(PI)于37℃中孵育30min，PBS漂洗;250μg/mL的PI染色。Rh123和/PI的荧光强度由Beckman Coulter公司的流式细胞仪检测。

　　1.4 蛋白免疫印迹法检测Caspases和PARP的表达 细胞用PBS清洗，用上样缓冲液(62.5mmol/L TrisHCl，pH 6.8，100mmol/L DTT，69mmol/L SDS，300mmol/L甘油，10mg/L溴酚蓝)裂解。总蛋白经80～120g/L的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜，用2g/L的丽春红染色以确定蛋白上样量是否相同。膜经50g/L的脱脂奶粉室温封闭1h后，用Cyt.c、活化的Caspase3(1∶1000)和PARP(1∶500，F2)的抗体4℃孵育过夜，经PBS充分漂洗后用HRP标记的二抗杂交。βactin抗体杂交，作为上样量的内参。

　　1.5 统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。结果以均数士标准差(±s)表示，组间比较采用χ2检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 DCA诱导细胞凋亡时线粒体跨膜电位下降 为了阐明DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡的机制，我们首先通过PI和Rh123双染检测该胆盐对于线粒体ΔΨm的作用。Rh123是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体ΔΨm成正比。正常的活细胞因为线粒体ΔΨm高，所以其摄入的Rh123也高，因此细胞会发出绿色荧光;而细胞发生凋亡时线粒体ΔΨm会降低，从而会减低对Rh123的吸收，细胞表现为Rh123低染。未处理的活细胞可被Rh123染色，而未被PI染色。当食管黏膜上皮细胞用100μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞在对照组为(1.8±0.6)%，36h为(8.1±0.2)%，48h为(30.5±1.7)%(图1A)，食管黏膜上皮细胞用200μmol/L的DCA处理后，PI阴性但Rh123低染的细胞36h可达(43.1±0.2)%(P<0.05)(图1B)。PI阴性但Rh123低染细胞的开始出现，并逐渐增加，DCA诱导的细胞凋亡时线粒体跨膜电位的下降，表明凋亡细胞在逐渐增多。

　　2.2 DCA诱导细胞凋亡时Cyt.c、Caspase3和PARP的活化

　　Cyt.c和活化的Caspase3的抗体显示，随着线粒体ΔΨm的下降，可检测到Cyt.c、Caspase3酶原也被剪切活化，产生17kd的活性片段(图2A)。与此相一致的是，在DCA处理后，Casapse3的底物PARP也发生了降解活化(图2B)。

　　2.3 Caspase3抑制剂部分抑制DCA诱导的细胞凋亡 用Caspase3特异的抑制剂DEVDFMK来研究Caspase3在DCA诱导食管上皮细胞凋亡中的作用。食管黏膜上皮细胞用50μmol/L的DEVDFMK预处理1h，再加入DCA处理细胞，蛋白免疫印法结果显示，DEVDFMK几乎可完全抑制DCA诱导的Caspase3的活化(图3A);annexinV/PI双染检测结果表明，细胞凋亡也仅受到部分抑制。食管黏膜上皮细胞单用300μmol/L DCA处理12h能显著诱导细胞凋亡，annexinV+/PI-细胞百分比为(34.3±0.5)%，而用Caspase3抑制剂DEVDFMK预处理组annexin V+/PI-细胞百分比降至(17.4±0.3)%，两者有明显统计学差异(P<0.05)，显示DCA的诱导细胞凋亡效应显著降低(图3B)。

　　2.4 Caspase3抑制剂对线粒体跨膜电位的下降没有影响 尽管蛋白免疫印法结果显示，DEVDFMK几乎可完全抑制DCA诱导的Caspase3的活化(图3A);annexinV/PI双染流式细胞仪检测结果表明，细胞凋亡也仅受到部分抑制。然而，DEVDFMK预处理并不显著影响DCA诱导的线粒体ΔΨm的下降，DCA处理组为(31.2±0.7)%，而DEVDFMK预处理组为(24.3±1.8)%，两者无显著统计学差异(P>0.05，图4)。

　　食管细胞经50μmol/L DEVDFMK预处理1h，再用300μmol/L DCA处理12h，蛋白免疫印迹检测Caspase3，βactin作为上样量的内参。A：流式细胞仪检测Annexin V/PI;B：△Caspase3为活化Caspase3;两者相比，*P<0.05。

　　3 讨 论

　　十二指肠胃食管反流中的胆酸(盐)已被确认为胃反流病中的一种致病因子。DCA是十二指肠反流中的重要成分，参与了对食管黏膜上皮细胞的损伤作用[79]。本实验结果证实，DCA可以引起食管上皮细胞凋亡时线粒体Cyt.c的释放和线粒体ΔΨm的下降。在结肠癌细胞系和其他细胞系中，胆酸(盐)对线粒体的毒性作用可使线粒体功能异常，从而增加线粒体Cyt.c的释放[5，10]，Cyt.c会从跨膜电位下降的线粒体的膜间隙中释放出来，与Aparf1及ATP结合形成凋亡体 (apoptosome)，激活Caspase9，活化的Caspase9又可激活Caspase3，而活化的Caspase3执行凋亡功能[11]。我们的结果显示，胆酸诱导的细胞凋亡伴有线粒体ΔΨm的下降、Caspase3和PARP的活化，但Caspase3特异的抑制剂仅能部分削弱DCA诱导的凋亡。Casapse3途径部分参与了胆酸诱导的食管黏膜上皮细胞凋亡，说明胆酸(盐)在不同细胞系中引起细胞凋亡的机制不完全相同。

　　线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体功能改变与细胞凋亡密切相关。许多因素，包括死亡受体介导的信号、促凋亡因子的释放、活性氧过度生成、能量产生障碍、胞质内钙失衡等生长因子抑制剂及毒素等，可以使线粒体的功能损伤，诱导细胞凋亡[12]。线粒体功能的损伤通过线粒体膜通透性增加介导，线粒体膜通透性转运孔道的开放使线粒体膜间隙存在的大量小分子蛋白物质释放出来，包括Cyt.c、Smac/DIABLO、Omi/HtrA2细胞凋亡诱导因子、核酸内切酶G，诱导半胱天冬肽酶依赖和非依赖性细胞凋亡[56，13]，Cyt.c释放被认为是凋亡过程中的关键事件[1415]。胆盐对线粒体的毒性作用可使线粒体功能异常，从而增加线粒体的Cyt.c的释放[16]。线粒体在细胞凋亡的发展过程中所起的重要作用，主要包括线粒体膜通透性转换(MPT)的发生和细胞凋亡早期中线粒体跨膜电位(ΔΨm)的降低，由此引起促凋亡物质释放等一系列变化，最终导致染色质浓集、DNA核小体间断裂等凋亡典型表现。线粒体内膜存在着一种质子泵，它将基质内质子泵入外室，从而形成横跨线粒体内膜内正外负的线粒体膜电位，在几乎各种类型的细胞凋亡中，均出现ΔΨm下降，并且这种改变发生于凋亡细胞的形态学改变之前，提示ΔΨm下降为凋亡早期阶段现象。本研究结果显示，胆酸诱导的细胞凋亡伴有线粒体ΔΨm的下降，提示胆酸诱导食管上皮细胞凋亡的早期有线粒体跨膜电位的变化，线粒体途径也参与其诱导食管上皮细胞凋亡的过程。

　　在细胞凋亡中起中心作用的是半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族成员，但它受到细胞线粒体途径的活化影响并相互作用。本实验观察到DCA作用后活化的Caspase3增多，证实其诱导培养的正常食管黏膜细胞的凋亡是以Caspase3的激活为信号途径。但是，Caspase3的激活是多种诱导凋亡信号的共同途径。例如，在凋亡的死亡受体途径、线粒体和内质网3种信号途径中均有Caspase3的激活。本研究结果显示，培养的正常食管黏膜细胞是通过线粒体信号途径、Caspase3系统来诱导食管黏膜细胞凋亡的。作为线粒体凋亡途径的主要物质Bcl2蛋白家族调节着凋亡的发生，其主要是抑制凋亡发生，其代表为Bcl2、Bclxl，而Bcl2家族的其他蛋白如Bax和Bad的表达增加则促进凋亡发生[1719]。胆酸通过Bcl2家族之一的Bid诱导激活Bax。Bax是胆酸诱导的线粒体Cyt.c释放的上游调控者[1619]。Bax穿入定位到线粒体，就伴随着线粒体通透性转变和Cyt.c的释放。Bcl2蛋白家族在调节胆酸诱导食管上皮细胞凋亡中的作用尚需进一步研究。

　　总之，DCA诱导食管黏膜上皮细胞凋亡可以通过线粒体途径，引起了线粒体通透性增高和膜电位下降，Cyt.c的释放、Caspase3和PARP的活化;抑制剂实验也证实，线粒体、Caspase3的活化共同参与了DCA诱导凋亡的过程。

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