survivin蛋白及其mRNA在子痫前期患者胎盘中的表达

　　　　 作者：李雪兰，李春芳，王少丽，苟文丽

【摘要】 目的 探讨survivin蛋白及其mRNA的表达与子痫前期的关系。方法 采用免疫组化SP法和实时荧光定量PCR(FQPCR)技术，检测20例轻度子痫前期、25例重度子痫前期和20例正常晚孕妇女胎盘组织中survivin蛋白及其mRNA的表达情况。结果 survivin蛋白主要位于绒毛小叶的合体滋养细胞及细胞滋养细胞，在子痫前期胎盘中的表达较正常晚孕妇女明显降低，且重度子痫前期的表达明显低于轻度;survivin mRNA在子痫前期胎盘中的表达也明显低于正常晚孕，重度明显低于轻度。结论 胎盘组织中survivin蛋白及其mRNA的异常表达可能在子痫前期的发生中起着重要的作用。

【关键词】 子痫前期;胎盘;survivin

　　ABSTRACT: Objective To detect the expressions of survivin protein and survivin mRNA in placenta of women with preeclampsia and normal pregnancy.Methods The expressions of survivin protein and survivin mRNA collected from placenta of 45 preeclampsia patients (20 cases of mild preeclampsia and 25 cases of severe preeclampsia) and 20 normal pregnant women were determined by immunohistochemistry. The image analysis technique was employed to analyze survivin protein. Realtime FQPCR was used to detect the placental expression of survivin mRNA.Results survivin protein was found mostly in syncytiotrophoblasts and cytotrophoblasts， and it was significantly lower in placenta of preeclampsia than that in normal placenta， and significantly lower in severe preeclampsia than in mild preeclampsia. survivin mRNA was significantly lower in preeclampsia than in normal placenta and significantly lower in severe preeclampsia than in mild preeclampsia.Conclusion The abnormal expressions of survivin protein and mRNA in placental tissues may play an important role in the pathogenesis of preeclampsia.

　　KEY WORDS: preeclampsia; placenta; survivin

　　子痫前期(preeclampsia)是妊娠期常见且严重威胁母婴健康的疾病。大量研究表明，子痫前期与滋养细胞的凋亡和浅着床有关，而survivin是一种抗凋亡作用较强的凋亡抑制因子。因此，本研究通过检测胎盘组织中survivin蛋白及mRNA的表达，探讨survivin与子痫前期的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 选择2007年10月至2008年10月在西安交通大学医学院第一附属医院产科住院分娩的正常晚孕妇女20例，平均年龄(27.6±2.4)岁，平均孕周(37.6±2.5)周;轻度子痫前期孕妇20例，平均年龄(25.8±3.2)岁，平均孕周(36.4±1.7)周;重度子痫前期者25例，平均年龄(26.1±2.4)岁，平均孕周(35.7±2.3)周。3组间的年龄与孕周无明显差异。所有标本均于剖宫产术中采集。胎盘娩出后立即剪取脐带附着周围的母面胎盘组织(避开钙化灶及机化灶)约1cm×1cm×1cm大小两块，一块立即放入1.5mL Eppendorf管(已预先用1mL/L DEPC水浸泡过夜，灭菌水淋洗，并于100℃烤干)，于-80℃冰箱保存，待测;另一块经100mL/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片。诊断标准依据乐杰主编的《妇产科学》第7版。

　　1.2 免疫组化SP法检测survivin蛋白的表达 兔抗人survivin多克隆抗体、即用型SP系列检测试剂盒均购自北京中杉生物技术公司，按说明书进行操作。用已知的survivin染色阳性的胃癌组织切片作阳性对照;以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。判定标准：survivin染色阳性主要定位于细胞质，以棕黄色、黄色、浅黄色为阳性细胞。在显微镜下拍摄照片，应用厦门麦克奥迪有限责任公司设计的Motic Med 6.0数码医学图像分析系统(A)进行灰度分析(细胞平均灰度值愈小，蛋白表达愈高)。

　　1.3 FQPCR法检测survivin mRNA的表达

　　1.3.1 RTqPCR试剂 Real time PCR试剂盒及反转录试剂盒(TwoStep RTPCR Kit AMP260802，Germany)，引物设计与合成(大连宝生物工程有限公司)。survivin引物序列：正向：5′TTCTCAAGGACCACCGCATC3′，

　　反向：5′GCCAAGTCTGGCTCGTTCTC3′。

　　1.3.2 Realtime PCR反应 按AmpliQ，Cat. No.260802，Germany试剂盒要求依次加入SYBR Green qPCR SuperMix 12.5μL、Forward primer

　　1μL、Reverse primer 1μL、cDNA 1μL、DEPCtreated water up to 25μL，构建PCR反应体系。每管于混匀离心后均加入20μL液体石蜡覆盖，置于ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪中按下述反应条件进行扩增，每样本3个复管。

　　PCR反应条件：预变性：95℃ 10min 1个循环;PCR反应：95℃ 30s，58～60℃ 1min，72℃ 30s共40～45个循环。测定各样本PCR反应液的溶解曲线，鉴定PCR产物的特异性。数据应用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software进行处理。采用样本中目的基因mRNA相对表达量计算公式，βactin作为内参照基因。按照下列公式计算样本中目的基因mRNA的相对表达量：△CT(目的基因)=目的基因CT-内对照基因CT，△△CT=△CT(目的基因)-△CT(标准值)，目的基因的相对总量为2-△△CT。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，统计学分析采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 survivin蛋白的表达情况 survivin蛋白阳性染色主要位于胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞及细胞滋养细胞胞质中(图1)。正常晚孕组、子痫前期轻度组及重度组的survivin灰度值分别为：93.3823±3.5654、105.8758±2.3004、112.6630±1.2082。与正常晚孕组比较，子痫前期两组胎盘组织中的survivin阳性表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);子痫前期两组比较，重度组的survivin阳性表达明显低于轻度组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明survivin在子痫前期轻度、重度胎盘组织中的阳性表达递减。

　　图1 正常晚孕者(A)及子痫前期(B)胎盘组织中survivin蛋白的表达

　　Fig.1 Expression of survivin protein of placenta in normal late pregnancy (A) and preeclampsia (B) (SP， ×400)

　　2.2 survivin mRNA的表达情况 子痫前期胎盘组织中survivin mRNA的表达明显低于正常晚孕组，且重度子痫前期者明显低于轻度者，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 正常晚孕者与子痫前期胎盘组织中survivin mRNA的表达

　　*示以正常晚孕表达为1，则子痫前期(轻度)其相对表达量为0.61;** 示以正常晚孕表达为1，则子痫前期(重度)其相对表达量为0.34;△示以子痫前期(轻度)表达为1，重度相对表达量为0.57。

　　3 讨 论

　　survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，也是IAP(inhibitor of apoptosis proteins)家族成员中最小的一个。在胎盘组织的细胞滋养细胞和滋养细胞起源的绒癌组织中均见IAP 基因及蛋白表达，认为其可能与细胞滋养细胞的侵袭、增殖能力有关。

　　有人认为子痫前期是一种胎盘疾病，其胎盘形态学改变包括细胞滋养细胞侵袭性降低和过度增生、合体滋养细胞形成减少和滋养细胞凋亡增加以及绒毛纤维素样坏死[12]。研究发现，子痫前期与胎盘凋亡异常有关，子痫前期孕妇胎盘滋养细胞凋亡显著增加，胎盘存在凋亡过度并与疾病的严重程度呈正相关[37]。

　　在整个妊娠过程中胎盘滋养细胞凋亡的异常，常常导致病理妊娠的发生。有研究发现，早孕绒毛滋养层细胞和蜕膜组织中存在survivin基因表达，在滋养细胞和腺上皮细胞中survivin呈高表达，有利于这些组织的内部稳定与分化。而在子痫前期患者滋养细胞中是否也存在着survivin基因的表达异常，尚需进一步探讨。

　　A LLAIRE[8]研究发现，survivin在子痫前期患者胎盘组织表达减少，引发胎盘组织细胞凋亡与增殖失调，滋养细胞的凋亡占优势，导致胎盘功能下降，从而引发子痫前期的一系列临床症候群。

　　本研究应用免疫组化及实时荧光定量PCR方法，检测胎盘组织中的survivin蛋白及mRNA的表达。结果显示，在正常晚孕和子痫前期孕妇胎盘组织中存在survivin蛋白及survivin mRNA的表达，且survivin蛋白、mRNA在子痫前期胎盘组织中的表达明显低于同期正常妊娠者，且随病情程度的加重而降低。说明子痫前期胎盘组织中抑凋亡基因表达下降、滋养细胞凋亡增加、血管重铸障碍，导致子痫前期的发生。有关survivin与子痫前期的关系，还需要进一步研究。

参考文献

　[1]TJOA ML， OUDEJANS CB， VAN VUGT JM， et al. Markers for presymptomatic prediction of preeclampsia and intrauterine growth restriction [J]. Hypertens Pregnancy， 2004， 23(2):171189.

　　[2]MYATT L， CUI X. Oxidative stress in the placenta [J]. Histochem Cell Biol， 2004， 122(4):369382.

　　[3]HUPPERTZ B， KINGDOM JC. Apoptosis in the trophoblastrole of apoptosis in placental morphogenesis [J]. J Soc Gynecol Investig， 2004， 11(6):353362.

　　[4]ABRAHAMS VM， KIM YM， STRASZEWSKI SL. Macrophages and apoptotic cell clearance during pregnancy [J]. Am J Reprod Immunol， 2004， 51(4):275282.

　　[5]ANTIPATIS C， ASHWORTH CJ， RILEY SC， et al. Vitamin A deficiency during rat pregnancy alters placental TNF alpha signalling andapoptosis [J]. Am J Reprod Immunol， 2002， 47:15121581.

　　[6]LEVY R， SMITH SD， YUSUF K， et al. Trophoblast apoptosis from pregnancies complicated by fetal growth restriction is associated with enhanced p53 expression [J]. Am J Obstet Gynecol， 2002， 186:1056210611.

　　[7]CROCKER IP， TANSINDA DM， BAKER PN. Altered cell kinetics in cultured placental villous explants in pregnancies complicated by preeclampsia and intrauterine growth restriction [J]. J Pathol， 2004， 204(1):1118.

　　[8]ALLAIRE AD， BALLENGER KA， WELLS SR， et al. Placental apoptosis in preeclampsia [J]. Obstet Gyneco， 2000， 96 (5):271276.