α硫辛酸对染铅幼年大鼠骨代谢的影响

　　　　 作者：裴丹，郑德宇，单伟，秦书俭

【摘要】 目的 探讨α硫辛酸对染铅大鼠骨代谢的影响。方法 将31只SD大鼠随机分为2组，空白对照组8只和铅染毒组(230mg/L的醋酸铅灌胃)23只，40d后各组取3只大鼠测血铅和骨铅，将已染铅大鼠随机分为4组，即铅对照组、3个α硫辛酸治疗组[30、60、100mg/(kg·d)]每组5只。α硫辛酸治疗80d后处死动物，测定血铅、骨铅，骨钙素放免分析法测含量，碱性磷酸酶免疫组化法检测表达。结果 ①各α硫辛酸治疗组大鼠血铅、骨铅水平均低于铅对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。②α硫辛酸100mg治疗组大鼠骨钙素含量、碱性磷酸酶表达与铅对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 α硫辛酸能够减轻铅对骨代谢的毒性作用。

【关键词】 α硫辛酸;铅;骨;骨钙素;碱性磷酸酶

　　ABSTRACT: Objective To determine the effects of αlipoic acid on bone metabolism in leadpoisoned rats.Methods Totally 31 SD rats were randomly pided into two groups， 8 rats in blank control group and 23 in lead group that received gastric lavage with lead acetate (230mg/L). After 40 days， 3 rats from each group were taken for the measurement of lead in the blood and bone. The rats in lead group were then randomly pided into four groups: lead control group and three lead groups with different concentrations of αlipoic acid [30， 60 and 100mg/(kg·d)]， with 5 rats in each. At the end of the experiment (80d)， the rats were killed and the samples of whole blood， serum and bone were collected to detect osteocalcin content with radioimmunoassay and alkaline phosphatase expression with immunohistochemistry staining.Results ① Blood and bone lead contents in each αlipoic treatment group were significantly lower than those in lead control group (P<0.05). ② After treatment with αlipoic acid of 100mg， osteocalcin content and alkaline phosphatase expression were significantly different from those in lead control group (P<0.05).Conclusion αlipoic acid can alleviate lead toxicity in bone metabolism.

　　KEY WORDS: αlipoic acid; lead; bone; osteocalcin (OC); alkaline phosphatase (ALP)

　　铅是一种严重危害人类健康的重金属。环境铅可通过呼吸道、消化道、皮肤进入人体，影响机体各系统功能[1]。现已经证明，铅在人体的分布，先在血液中进行，然后经再分布过程，最终铅负荷的95%储存在骨中。铅对骨骼系统的影响日益受到人们的广泛重视。石凯丽等[2]研究表明Ⅲ级铅中毒儿童血清骨钙素(osteocalcin， OC)较I级铅中毒儿童显著下降(P<0.01)，骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)显著增高(P<0.01)，骨的正常矿化受到了影响从而影响骨的发育。α硫辛酸(alphalipoic acid， LA)是已知最强的天然抗氧化剂之一，作为一种辅酶通过参与氧化脱羧反应，而使糖、脂、氨基酸代谢相互协调，并可解除重金属对含巯基酶的毒害[36]。但是，LA是否具有拮抗铅对生长期骨骼的毒害作用，国内外暂未见报道。本文通过观察不同浓度α硫辛酸对染铅幼年大鼠骨代谢的影响，为深入研究铅中毒的治疗及其作用机制提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器和试剂 ①主要仪器：TAS986石墨炉原子吸收仪，SN695放免分析仪，Leitzl512组织切片机，PM6 Olympus倒置相差显微镜。②主要试剂：醋酸铅(沈阳市试剂二厂)，α硫辛酸(Sigma公司)，骨钙素放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)。

　　1.2 动物模型及分组 健康断乳SD大鼠31只，体重(100±6.23)g，雌雄不限，购自辽宁医学院实验动物中心，观察3d无异常后进行实验。大鼠随机分为2组，分别为空白对照组(A组，8只，1～40d蒸馏水灌胃)，实验组：铅染毒组(23只，1～40d 230mg/L的醋酸铅灌胃)，40d后各组取3只大鼠测全血铅和骨铅。将已染铅大鼠随机分为4组，每组5只，即无措施铅对照组(B)(41～120d生理盐水腹腔注射)、LA治疗组[41～120d分别用30(C)、60(D)、100(E)mg/(kg·d)的α硫辛酸腹腔注射]。每天定时注射，期间各组大鼠均饲常规饲料、饮蒸馏水。第121天处死动物，颈动脉取血，取大鼠两侧股骨，-80℃冰冻待用。

　　1.3 血铅、骨铅含量的测定 取血样0.1mL，加稀释液

　　0.9mL摇匀后待测。精确称量骨样，放入聚四氟乙烯容器中。加1mL纯硝酸，2mL 300mL/L的过氧化氢放入消化罐内，于120℃消化2h，取出消化罐，将消化液移出。取消化液0.1mL，加去离子水0.9mL稀释，摇匀后待测。取出预处理后的样品，用TAS986原子吸收分光光度计石墨炉法检测。波长283.3nm，采用铅标准液做出标准曲线，再测待测样本。

　　1.4 碱性磷酸酶的免疫组织化学染色 取骨干组织包块，作5μm厚切片。将石蜡切片脱蜡至水，30mL/L h3O2室温孵育，以消除内源性过氧化物酶，经pH 6.0的枸橼酸缓冲液中行抗原热修复，50mL/L正常山羊血清封闭后加入1∶100稀释的一抗(碱性磷酸酶)，4℃过夜。滴加生物素标记的二抗37℃孵育30min，滴加ABC试剂37℃孵育30min后DAB显色，常规脱水、透明、封片。以上各步骤均用PBS冲洗，同时用PBS代替一抗设置阴性对照。棕黄色颗粒代表阳性结果。

　　1.5 骨钙素的放射免疫分析 大鼠处死后颈动脉取血，冰上放置1h，4℃，3000r/min，离心10min，上层血清移至无菌1.5mL EP管中-20℃冰箱保存，集中检测。采用放射免疫分析法测定大鼠外周血清中OC的含量。用SN695免疫计数器测定。

　　1.6 统计学分析 数据用±s表示，数据处理应用SPSS of Windows 13.0统计软件包。采用方差分析进行多组间比较后，q检验行两两比较，以P<0.05表示差异有显著性意义。

　　2 结 果

　　2.1 α硫辛酸对染铅大鼠血铅、骨铅及血清骨钙素含量的影响 B组大鼠全血铅、骨铅含量较A组显著升高，同期各α硫辛酸治疗组血铅、骨铅含量较铅染毒组均有所降低，B组血清骨钙素含量较A组显著降低，同期各α硫辛酸治疗组血清骨钙素含量较B组均有所升高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。表1 α硫辛酸对各组大鼠血铅、骨铅水平及血清骨钙素含量的影响

　　2.2 碱性磷酸酶的免疫组织化学染色情况 碱性磷酸酶免疫组化阳性表达主要定位于成骨细胞。B组可见大量的阳性基质区域，A组部分区域偶见细胞胞浆内出现棕黄色的颗粒，C、D组阳性细胞数量增多，部分区域基质内出现均一棕黄色区域，E组可见少量的阳性细胞(图1)。

　　3 讨 论

　　本实验观察到，各LA治疗组血铅、骨铅水平较铅对照组均有显著下降(P<0.05)。有文献报道[7]，摄入适量的含硫氨基酸可以增加谷胱甘肽的生物利用度，从而有利于铅的排泄。LA能由动物和人体合成，可作为几种复合酶的辅助因子。它的还原形式二羟基硫辛酸，含有游离的巯基基团。实验中观察到LA对硫基有一定的保护作用，能降低血铅、骨铅含量，可能与LA是一种含硫氨基酸有关。

　　OC又称为骨羧基谷氨酸蛋白，主要由成骨细胞合成分泌，是骨组织中最丰富的非胶原蛋白。骨钙素大部分沉积在细胞外骨基质，新合成的小部分释放入血循环。骨钙素在血清中的含量与成骨细胞合成的总量呈正相关，故血清骨钙素可作为骨形成的临床指标，特异地反映成骨细胞的活性、功能[8]。骨钙素是反映骨形成的有效指标，钙可诱导骨钙素α螺旋构象

　　的形成且促进骨钙素正常的羟磷基化。低水平的铅可以取代骨钙素上的钙，且铅与骨钙素的亲和力远高于钙。铅可以在浓度远低于钙时诱导出比例相当的具有α螺旋构象的骨钙素，且抑制骨钙素与羟磷灰石的结合，从而降低了钙沉积和骨形成[9]。铅抑制骨钙素的表达，骨钙素表达的降低则直接导致了骨量的减少，骨量的减少必然令骨骼的生长(增长增粗)受阻。而本实验结果显示，铅处理会造成大鼠血清骨钙素降低，这与胡雪琴等[10]的研究结果是一致的。治疗后大鼠血清骨钙素逐渐升高。LA的治疗减轻铅的这种毒害作用。表明钙和铅可能通过相互作用(竞争或取代)影响了骨骼的生长发育。铅对骨骼生长的抑制作用可能是通过干扰骨钙素的合成和分泌来实现的。

　　BALP是一种胞内酶，存在于成骨细胞。由成骨细胞合成分泌、释放入血，可以有效地监测骨矿化的速度。骨碱性磷酸酶增加是骨化作用减弱并停留在成骨细胞阶段的标志。石凯丽等[2]研究表明Ⅲ级铅中毒儿童血清OC较I级铅中毒儿童显著下降(P<0.01)，BALP显著增高(P<0.01)。由此可见血铅增高在一定程度上抑制了成骨细胞的功能，使OC的分泌减少，而BALP相应增高，骨的正常矿化受到了影响。这可能是铅直接抑制成骨细胞功能以及铅中毒后儿童体内钙、磷水平相对较低的缘故[11]。本实验中观察到铅染毒组ALP阳性表达明显增多，LA治疗有改善作用。这可能是LA拮抗铅对成骨细胞的破坏作用，但其具体机制还有待进一步阐明。

　　α硫辛酸是1951年由Reed首次从猪肝中分离出来的天然产物[12]，其在体内吸收进入细胞后，可还原成二氢硫辛酸并释放到细胞外。因此，单独给予α硫辛酸后，在体内以α硫辛酸和二氢硫辛酸两种形式存在，它们协同作用，共同组成一种“万能抗氧化剂”(universal ntioxidant)[13]。GURER等[14]利用CHO细胞和Fischer344大鼠的研究发现，LA处理能显著增加Fischer344大鼠和CHO细胞的GSH水平，降低MDA含量，显示较强的抗氧化作用。但是，对红细胞、脑、肾脏中的铅水平没有影响。提示LA对铅毒动物及细胞的保护作用与其络合排铅能力无关，可作为一种良好铅毒辅助治疗剂[15]。

参考文献

　　[1]AMUNDSEN T， NAESS IA， HAMMERSTROM J， et al. Lead poisoning——an overview [J]. Tidsskr Nor Laegeforen， 2002， 122(15):14731476.

　　[2]石凯丽，马宏，王文英，等. 铅对儿童骨代谢的影响 [J]. 中国儿童保健杂志， 2004， 12(2):109111.

　　[3]PACKER L， TRISCHLER HJ， WESSEL K. Neuropurotection by the metabolic antioxidant alpha lipoic acid [J]. Free Rad Biol & Medi， 1997， 22(12):359378.

　　[4]闻芝梅，陈君石. 现代营养学 [M]. 北京：人民卫生出版社，1999:267329.

　　[5]何崇. 维生素和微量元素的科学应用 [M]. 上海：上海中医药大学出版社， 2003:1964.

　　[6]黄涛，黄开勋. α硫辛酸的生物医学功能 [J]. 生命化学， 2004， 24(1):58.

　　[7]刘永泉，樊晶光，常元勋. 驱铅治疗辅助药物的研究进展 [J]. 国外医学卫生学分册， 1997， 24(1):1011.

　　[8]张利，王文英，陈连元，等. 佝偻病患儿成骨细胞分子标志物的研究 [J]. 中国儿童保健杂志， 2002， 10(6):403405.

　　[9]DOWD TL， ROSEN JF， MINTSS L， et al. The effect of Pb(2+) on the structure and hydroxyapatite binding properties of osteocalcin [J]. Biochem Biophys Acta， 2001， 1535(2):153163.

　　[10]胡雪琴，糜漫天. 钙对染铅大鼠骨钙素、甲状旁腺激素及其受体表达的影响 [J]. 营养学报， 2007， 29(4):328331.

　　[11]石凯丽，王文英. 铅对儿童骨代谢的影响机制 [J]. 国外医学儿科学分册， 2002， 23(6):289291.

　　[12]REED LJ， DEBUSK BG， GUNSALUS IC， et al. Crystallineαlipoic acid：A catalytic agent associated with pyruvate dehydrogenase [J]. Science， 1951， 114:93.

　　[13]KAGAN V， SHVEDOVA A， SERBINOVA E， et al. Dihydrohpoic acidAuniversal antioxidant both in the membrane and in the aqueous sphase.Reduction of peroxyl，ascorbyl and chromanoxyl radicals [J]. Biochem Pharmacol， 1992， 44(8):16371649.

　　[14]GUER H， OZGUNES H， OZTEZCAN S， et al. Antioxidant role of alphalipoid acid in lead toxicity [J]. Free Radic Biol Med， 1999， 27(12):7581.

　　[15]NEAL R， COOPER K， GURER H， et al. Effects of Nacetylcystenie and 2， 3dimercaptosuccinc acid on lead induced oxidative stress in rat lenses [J]. Texicology， 1998， 130(23):167174.