中国汉族男性人群D氨基酸氧化酶激活剂基因多态性与精神分裂症的关联研究

　　 作者：韩燕，宁启兰，张欢，王淑红，张富军，马雪红，高成阁，马捷

【摘要】 目的 研究中国男性群体中D氨基酸氧化酶激活剂(DAOA)基因多态性与精神分裂症的相关性。方法 采用等位基因特性PCR方法对272例男性精神分裂症患者和206例对照DAOA基因区域的3个单核苷酸多态性位点(SNP：rs778294，rs778293和rs3918342)进行基因分型和统计分析。结果 DAOA基因区域rs778294的一个等位基因(C)与精神分裂症显著相关(P=0.03)。由3个SNP构建的单倍型分析表明，单倍型CAT在病例对照组中表现出显著的差异。结论 在中国汉族男性群体中，DAOA基因可能是精神分裂症的一个易感基因，NMDA受体途径可能是发生精神分裂症的一个重要潜在因素。

【关键词】 精神分裂症;D氨基酸氧化酶激活剂;单核苷酸多态性;连锁不平衡;关联

　　ABSTRACT: Objective To examine the correlation betweenDaminoacid oxidase activator (DAOA) gene polymorphisms and schizophrenia in the Han Chinese males.Methods We genotyped three singlenucleotide polymorphisms (rs778294， rs778293 and rs3918342) in DAOA gene region in 272 male patients with schizophrenia and 206 controls using allele specific real time PCR.　Results Significant association between the C allele of marker rs778294 and schizophrenia was found (P=0.03). Furthermore， the analysis by multiple haplotype constructed with three SNPs revealed a strongly significant difference for the common haplotype CAT between case and control groups.Conclusion DAOA gene may be a candidate susceptibility gene for schizophrenia in the Han Chinese males， and the NMDA receptor pathway may play a potential important role in the etiology of schizophrenia.

　　KEY WORDS: schizophrenia; Daminoacid oxidase activator (DAOA); single nucleotide polymorphisms ((SNP); linkage disequilibrium (LD); correlation

　　精神分裂症(MIM 181500)在人群中的发病率大约为1%，表现为幻听、幻视、认知改变、情绪激动和行为异常。在各种致病因素中，遗传因素大概占80%，同时表现为多个微效基因共同作用的结果[1]。此外，精神分裂症的患病率与发病年龄在男性与女性之间存在差异，青年期男性发病比例高于女性，而中年以后女性发病比例则高于男性[2]。

　　近年来，许多研究都表明染色体13q22～34区域与精神分裂症连锁[3]。随后，有报道位于染色体13q33的D氨基酸氧化酶激活剂(DAOA)基因与精神分裂症显著性相关[4]。目前已知，DAOA蛋白可以与位于染色体12q24的编码D氨基酸氧化酶的基因(DAAO)相互作用，通过N甲基D天冬氨酸盐(NMDA)受体途径来调节谷氨酸能神经递质系统[4]。

　　在荟萃分析报道中，SHI等[5]在亚洲和欧洲人群中都发现了DAOA座位与精神分裂症的阳性结果。随后，MA等[6]在中国汉族三口之家中的研究发现，不但DAOA座位与精神分裂症相关联，而且这种关联在男性中表现得较为明显。但是，该项研究使用的样本量较小(男性患者仅73人)，这必然造成统计效力的不足。因此，本研究在更大的样本量中重复该项研究，选取了272例男性患者和与之匹配的206例正常男性作为研究对象，并运用连锁不平衡(linkage disequilibrium， LD)分析方法研究DAOA座位在精神分裂症易感性中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 所有样本在收集时都与患者和对照人群签署了知情同意书。每位患者诊断依据临床检查和医院病史记录，参照精神疾病的诊断和统计指南(DSMIV)标准进行。二次对所有患者的病历资料按同一诊断标准进行复核。

　　样本共计478份，其中包括精神分裂症男性患者272人，平均年龄(28.9±13.2)岁，平均发病年龄(25.3±8.8)岁，来自于西安交通大学医学院第一和第二附属医院精神科。正常对照男性共有206人，均无神经病史或重要的精神疾病，平均年龄(28.2±8.0)岁，来自于西安市几家较大医院的正常体检者。所有人都是汉族起源。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA提取 采用经典酚氯仿法。

　　1.2.2 基因分型 在DAOA座位附近的单核苷酸多态性位点中选取了3个位点(SNP：rs778294，rs778293和rs3918342)，这些位点在亚洲和欧洲人群的研究中均显示了等位基因与精神分裂症的显著性关联[56]。基因分型使用等位基因特异性PCR方法，设计引物在两个独立的PCR反应中特异性扩增不同的等位基因。每个样品准备两个PCR反应体系(5μL)：10～20ng基因组DNA，2.5μL TaqMan universal PCR master mix (Applied Biosystems)，0.2μmol/L等位基因特异性引物，0.2μmol/L通用引物和0.2倍SYBR Green I(Molecular Probe， Inc.)。反应条件依据TaqMan universal PCR master mix的使用说明书：先在50℃孵育2min，然后95℃下12min灭活UNG酶并启动热启动DNA聚合酶。热循环条件为：95℃，15s，30s退火温度，55个循环后结束。PCR引物(表1)由tetraprimer ARMSPCR引物设计程序设计。为了保证所获得基因分型数据的正确性，将随机选出的48份DNA样本用这3个SNPs重新进行基因分型，所获得的结果与第1次基因分型的结果相符，没有发现任何基因分型错误。表1 等位基因特异性PCR所使用的遗传标记和引物a 为了提高基因分型效率，在正向引物3′端倒数第3位引入碱基错配。

　　1.2.3 数据分析 原始数据的处理与分析用Excel2003(Microsoft)及SPSS 11.0(SPSS Inc.)。使用Finetti软件程序对3个SNPs进行哈迪温伯格平衡检验。使用软件程序对SNPs的等位基因进行卡方检验。使用2LD软件程序对数据进行连锁不平衡分析，并计算出D值。根据D’值构建单倍型，使用PHASE软件程序进行单倍型分析。所有单倍型在患者和正常之间的分布由EpiInfo软件程序进行比较。Yates校正被用于进行各个统计学检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　在272例中国汉族男性精神分裂症患者样本以及相应的206例正常汉族男性对照样本中，

　　位于DAOA基因区域的3个SNP的等位基因的频率如表2所示，这3个SNP位点都具有高度的多态性。哈迪温伯格平衡检验病例组和对照组，均符合哈迪温伯格平衡

　　(P>0.05)。对于遗传标记rs778294，在患者和对照之间发现等位基因C的分布频率(χ2=4.70，P=0.030)存在显著性差异。进一步经过Yates校正后，遗传标记rs778294的等位基因分布仍然保持显著性的差异(P=0.038)。

　　在3个SNP的连锁不平衡的分析中，没有显示LD(D<0.5)现象(表3)。由于3个位点(rs778294，rs778293和rs3918342)之间不存在LD，因此都被用来构建单倍型，并进行多位点的单倍型分析。统计后共出现了8种单倍型，但是有2种单倍型由于出现频率过低(<3%)，因此被排除在分析之外[7](表4)。

　　单倍型分析发现所有单倍型在患者和对照组中的分布存在显著性差异(整体P=0.032)。在病例和对照之间比较单个单倍型分布频率时，发现常见单倍型CAT有显著性差异(χ2=8.20，P=0.004)，其频率在病例组中明显偏低(24.8%对33.2%);另一常见单倍型CGC也显示了显著性差异的趋势(χ2=3.41， P=0.065)，其频率同样在病例组中较低(20.6%对22.2%)。对检验结果进行Yates校正后，单倍型CAT仍保持显著性差异(P=0.005)。表2 病例组和对照组中遗传标记的等位基因分布频率表3 遗传标记之间的连锁不平衡状态的模拟分析(D)

　　3 讨 论

　　目前，有关性别与精神分裂症患病风险的研究已有较多报道，但是所取得的结果并不一致[2]。本研究为了检验DAOA基因和男性精神分裂症患者之间的关系，在中国汉族男性样本中对3个SNP位点(rs778294、rs778293和rs3918342)进行基因分型和统计分析。

　　发现遗传标记rs778294和精神分裂症之间有显著性关联(P=0.030)，经过Yates校正后，这种显著性差异仍然存在(P=0.038)，表明这种显著性差异不是一个假阳性结果。通过生物信息学的分析，发现遗传标记rs778294(C to T)位于DAOA最后一个外显子的上游15bp处，恰好处在形成成熟mRNA时的剪切区域，因此rs778294的多态性很可能会影响到DAOA基因转录时的剪切过程，从而影响功能[6]。

　　单倍型分析利用了遗传标记之间的连锁不平衡信息，可以基于个别SNP的关联分析而得出更多的关联分析的统计数据[8]。因为3个遗传位点之间不存在连锁不平衡(D<0.5)，所以3个位点都用来构建单倍型(rs778294rs778293rs3918342)，并进行单倍型分析。事实上，类似的连锁不平衡结果在其他人群中已有报道[8]。本研究对单倍型分析结果显示，DAOA基因与疾病具有显著性关联(整体P=0.032)。比较病例和对照中的每种单倍型，发现常见单倍型CAT在患者中出现频率远低于对照组，显示显著性差异(P=0.004)，表明单倍型CAT很可能是一种保护因素[8]。此外，另一常见单倍型CGC也显示出了差异趋势(P=0.065)，进一步支持DAOA基因在男性精神分裂症患者的致病中起到了一定作用。

　　综上，该研究进一步证实了DAOA基因是精神分裂症的一个易感基因，可能是通过DAAO对D丝氨酸的氧化作用来削弱NMDA受体的活性而致病的[3]。

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