鼻咽癌组织中信号转导与转录活化因子3与潜伏膜蛋白1的表达及其关系

【摘要】 目的 研究鼻咽癌组织中信号转导与转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)的表达和活化状态及其与爱泼斯坦-巴尔病毒(EpsteinBarr virus， EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1， LMP1)表达的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测45例鼻咽癌、27例慢性鼻咽炎组织中LMP1、STAT3和磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白的表达并分析其相关性。结果 鼻咽癌组织中LMP1、STAT3和pSTAT3蛋白的阳性率均高于慢性鼻咽炎组织(P<0.01)。相关分析结果显示， LMP1和pSTAT3表达呈正相关关系(rs=0.302，P<0.05)，但LMP1与STAT3表达无明显相关(P>0.05)。结论 鼻咽癌组织中存在STAT3蛋白高表达和异常激活;LMP1可能参与STAT3的活化。

【关键词】 鼻咽肿瘤;信号转导与转录活化因子3;潜伏膜蛋白1

　　ABSTRACT: Objective To study the expression and activation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in human nasopharyngeal carcinoma(NPC) tissues and its relation with the expression of latent membrane protein 1 (LMP1) encoded by EpsteinBarr virus.Methods The expressions of LMP1， STAT3 and phosphated STAT3 (pSTAT3) in 45 cases of NPC and 27 cases of chronic nasopharyngitis were studied by immunohistochemical method. Correlation between protein expressions was analyzed.Results The positive rates of LMP1， STAT3 and pSTAT3 in NPC were significantly higher than those in chronic nasopharyngitis (P<0.01). There was a positive correlation between the expressions of LMP1 and pSTAT3 (rs=0.302， P<0.05)， but no obvious correlation between LMP1 and STAT3 expressions (P>0.05).Conclusion There are overexpression and abnormal activation of STAT3 protein in NPC tissues. LMP1 may play a role in the activation of STAT3.

　　KEY WORDS: nasopharyngeal carcinoma (NPC); signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3); latent membrane protein 1(LMP1)

　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，目前认为其发病与爱泼斯坦巴尔病毒(EpsteinBarr virus， EBV)感染、遗传及环境等因素有关。EBV编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1， LMP1)由于能转化小鼠成纤维细胞并在裸鼠体内成瘤而被视为EBV的瘤基因[1]。信号转导和转录活化因子(signal transducers and activators of transcription， STATs)家族是一种存在于胞质并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白家族。STATs家族成员中，STAT3与肿瘤的关系最为密切[2]。目前，对于STAT3在鼻咽癌中表达及其与LMP1相关性的研究报道甚少，本文研究鼻咽癌组织中STAT3的表达及其与LMP1的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 收集广东医学院附属医院2005～2006年石蜡标本，共72例。其中鼻咽癌标本45例(男26例，女19例，均为鼻咽非角化性癌)，患者年龄18～76岁，中位年龄49岁。慢性鼻咽炎标本27例(男16例，女11例)，患者年龄16～79岁，中位年龄47岁。所有病例资料完整，诊断前均未行放疗或化疗。

　　1.2 主要试剂 鼠抗人LMP1单克隆抗体(克隆CS.1～4)购自丹麦DAKO公司，兔抗人STAT3多克隆抗体购自美国Neomarkers公司，兔抗人磷酸化STAT3(PhosphoTyr705)多克隆抗体为美国Signalway公司产品。SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉公司。

　　1.3 实验方法 采用免疫组化SP法。用已知的阳性标本作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。全部标本经 100mL/L中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。切片经常规脱蜡、水化后，高压修复抗原，30mL/L过氧化氢孵育5min以阻断内源性过氧化物酶;正常山羊血清封闭20min。滴加稀释好的一抗(LMP1为1∶100稀释，STAT3和pSTAT3均为1∶50稀释)，4℃过夜孵育。滴加1∶100生物素标记的二抗，室温孵育15min。滴加辣根过氧化物酶标记的卵白素，室温孵育15min。DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、中性树脂封片。

　　1.4 结果判断 每一批免疫组化染色均设已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。LMP1阳性表达定位于胞膜和胞质，STAT3阳性表达定位于胞质，

　　pSTAT3阳性表达定位于胞核和胞质。由两名病理诊断医生分别对实验结果进行双盲法评估。每一切片随机选择5个视野(×100)，在显微镜(×400)下计数每个视野100个肿瘤细胞，非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞的比例，取5个视野的平均百分数为判定结果。评分标准参照文献[34]作适当修改：阳性细胞数≤5%为0分;6%～25%为1分;26%～50%为2分;

　　51%～75%为3分;>75%为4分。染色强度：0分为无染色;1分为淡黄色;2分为棕黄色;3分为深棕色。免疫组化染色结果根据阳性细胞数和染色强度分别评分，两者乘积0～1分为阴性(-);2～3分为阳性(+);4分以上为强阳性()。

　　1.5 统计学分析 实验资料采用统计学软件SPSS for Windows 11.0做四格表的卡方检验，Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 STAT3、pSTAT3和LMP1蛋白在鼻咽癌及慢性鼻咽炎组织中的表达情况 STAT3和pSTAT3蛋白在癌细胞中多呈阳性或强阳性表达;癌旁组织的淋巴细胞及慢性鼻咽炎黏膜上皮细胞中也有少量表达，但表达强度远不及癌细胞。STAT3蛋白表达定位于细胞胞质，

　　pSTAT3蛋白主要以胞核表达为主，胞质也有不同程度的表达。LMP1主要表达于癌细胞胞膜和胞质，染色强度从淡黄色到棕黄色不等。鼻咽癌组织中STAT3、pSTAT3及LMP1的阳性率均明显高于慢性鼻咽炎组织，差异有统计学意义(P<0.01，表1及图1)。其中19例鼻咽癌组织表现为STAT3和pSTAT3共阳性表达。表1 鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中STAT3、pSTAT3及LMP1的表达情况

　　2.2 鼻咽癌组织中LMP1和STAT3、pSTAT3表达的相互关系 Spearman相关性分析结果表明，鼻咽癌组织中，LMP1和pSTAT3表达呈正相关(rs=0.302，P<0.05);LMP1与STAT3表达无明显相关(P>0.05，表2)。表2 鼻咽癌组织中LMP1和STAT3及pSTAT3表达的相互关系

　　3 讨 论

　　STAT3为一种胞质蛋白，被多种细胞因子、生长因子及细胞内酪氨酸蛋白激酶等激活后其第705位酪氨酸磷酸化而pSTAT3蛋白随后形成蛋白二聚体并转位入核，结合在特定基因的启动子上，诱导相应基因的表达[5]。

　　在正常生理状态下，STAT3的激活是快速而短暂的，对于正常细胞的生理功能起着重要作用。STAT3过度激活后诱导cmyc、cyclinD1等多种与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因的异常高表达，从而促进细胞增殖和恶性转化，表现出致癌作用[6]。由于持续激活的STAT3会使培养细胞发生恶性转化并能在裸鼠中形成肿瘤[7]，STAT3已被认为是一种癌基因。研究发现，STAT3在人类多种恶性肿瘤如血液系统肿瘤、头颈部鳞状细胞癌中持续激活[89]。

　　HSIAO等[10]发现STAT3在鼻咽癌中有高表达，但其活化情况尚不清楚。本研究同时观察了鼻咽癌组织中STAT3和pSTAT3蛋白的表达，发现鼻咽癌组织中STAT3和pSTAT3表达水平均明显高于慢性鼻咽炎组织，提示鼻咽癌组织中STAT3不仅高表达，并且呈持续激活状态，STAT3蛋白在鼻咽癌发展过程中可能扮演重要的角色。

　　LMP1是EBV编码的具有转化细胞功能的癌基因。CHEN等[11]研究发现在鼻咽癌细胞中，LMP1可通过上调白细胞介素6(IL6)的表达而激活STAT3，而STAT3可与EB病毒LMP1启动子结合，促进基因的转录，从而形成一个正反馈调节机制，促使STAT3在鼻咽癌中持续活化及LMP1持续表达。在鼻咽癌组织的研究中，LMP1与STAT3表达是否有相关性的结果尚不一致[1213]。因此，我们利用STAT3非磷酸化及磷酸化抗体分别检测鼻咽癌组织中STAT3的表达水平及其活化状态。结果发现，鼻咽癌组织中LMP1表达与pSTAT3表达呈正相关，而与STAT3表达无明显相关，这提示了鼻咽癌组织中LMP1可能通过某些机制直接活化STAT3，而对STAT3的表达水平无明显影响。由于LMP1调节了多种基因的表达，除了IL6外，LMP1还可通过哪些途径影响STAT3的活化有待进一步的研究。

参考文献

　[1]HU LF， CHEN F， ZHENG X， et al. Clonability and tumorigenicity of human epithelial cells expressing the EBV encoded membrane protein LMP1 [J]. Oncogene， 1993， 8(6):15751583.

　　[2]HODGE DR， HURT EM， FARRAR WL. The role of IL6 and STAT3 in inflammation and cancer [J]. Eur J Cancer， 2005， 41 (16):25022512.

　　[3]LU CD， ALTIERI DC， TANIGAWA N， et al. Expression of a novel antiapoptosis gene， survivin， correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas [J]. Cancer Res， 1998，58(9):18021812.

　　[4]王亚利，王中卫，王西京，等. Livin、survivin在乳腺癌中的表达及其与caspase3和临床病理的相关性 [J]. 西安交通大学学报：医学版， 2009， 30(4):466469.

　　[5]DECKER T. Introduction: STATs as essential intracelluar mediators of cytokine response [J]. Cell Mol Life Sci， 1999， 55(12):15051508.

　　[6]COSTANTINO L， BARLOCCO D. STAT3 as a target for cancer drug discovery [J]. Curr Med Chem， 2008， 15(9):834843.

　　[7]TURKSON J， BOWMAN T， GARCIA R， et al. Stat3 activation by Src induces specific gene regulation and is required for cell transformation [J]. Mol Cell Biol， 1998， 18(5):25452552.

　　[8]BENEKLI M， XIA Z， DONOHUE KA， et al. Constitutive activity of signal transducer and activator of transcription 3 protein in acute myeloid leukemia blasts is associated with short diseasefree survival [J]. Blood， 2002， 99(1):252257.

　　[9]GRANDIS JR， DRENNING SD， ZENG Q， et al. Constitutive activation of Stat3 signaling abrogates apoptosis in squamous cell carcinogenesis in vivo [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97(8):42274232.

　　[10]HSIAO JR， JIN YT， TSAI ST， et al. Constitutive activation of STAT3 and STAT5 is present in the majority of nasopharyngeal carcinoma and correlates with better prognosis [J]. Br J Cancer， 2003， 89(2):344349.

　　[11]CHEN H， HUTTFLETCHER L， CAO L， et al. A positive autoregulatory loop of LMP1 expression and STAT activation in epithelial cells latently infected with EpsteinBarr virus [J]. Virol， 2003， 77(7):41394148.

　　[12]姚运红， 李飞虹， 蔡琼珍， 等. VEGF与Stat3及其靶基因产物在鼻咽癌中的表达[J]. 中国肿瘤临床， 2006， 33(15):858861.

　　[13]韩安家， 宗永生， 何洁华， 等. STAT3在鼻咽癌中的表达特征及其与bcl2和LMP1表达的关系[J]. 肿瘤防治杂志， 2005， 12(2):8184.