小剂量顺铂增加人宫颈癌Hela和Siha细胞对光动力治疗敏感性的研究

　　　　 作者：王海燕，张友忠，姜侃，焦慧，王兆婧

【摘要】 目的 探讨小剂量顺铂增加人宫颈癌Hela和Siha细胞系对光动力治疗的敏感性及细胞凋亡的机理。方法 将Hela和Siha细胞分为空白对照组、单纯光动力治疗组、单纯顺铂治疗组和光动力加顺铂治疗组，MTT法检测各组人宫颈癌细胞株Hela和Siha的增殖情况。采用免疫细胞化学法检测各组Hela和Siha细胞受作用后P185cerbB2蛋白的表达情况。结果 顺铂和光动力治疗联合应用导致细胞凋亡的程度均明显强于单一顺铂作用或光动力作用，细胞中P185cerbB2蛋白的表达下降程度也与之相一致。但是先顺铂后光动力治疗和先光动力治疗后顺铂相比，作用效果差异不明显。结论 顺铂和光动力联合治疗在体外对人宫颈癌Hela和Siha细胞有明显增殖抑制作用，强于单独一种方法治疗，其机理可能与抑制P185cerbB2表达有关。

【关键词】 5氨基酮戊酸;顺铂;光动力疗法;免疫细胞化学;宫颈癌细胞株

　　ABSTRACT: Objective To investigate the mechanism of smalldose cisplatin in enhancing photodynamic therapy sensitivity and apoptosis in human cervical carcinoma cell lines.Methods The Hela and Siha cells were pided into four groups (blank control group， photodynamic therapy only， cisplatin only， photodynamic therapy and cisplatin). The effects on proliferation of Hela and Siha cells in the four groups were examined by MTT assay. The expression of P185cerbB2 in Hela and Siha cells affected was detected by immunocytochemistry.Results The degree of apoptosis caused by the joint application of cisplatin and photodynamic therapy was greater than that caused by cisplatin or photodynamic therapy alone. The expression of P185cerbB2 in cells declined correspondingly. However， the order of cisplatin and photodynamic therapy did not cause obvious differences in the effect.Conclusion The in vitro proliferation of Hela and Siha cells is restrained obviously by cisplatin combined with photodynamic therapy; the effect is greater than that of cisplatin or photodynamic therapy only. The mechanism of cispatins enhancement of photodynamic therapy sensitivity may be related to inhibiting P185cerbB2 expression.

　　KEY WORDS: 5aminolevulinic acid; cisplatin; photodynamic therapy; immunohistochemistry; cervical carcinoma cell line

　　顺铂(cisplatin)全称为顺式二氯二氨铂(cisdiammine dichloroplatinum， DDP或CDDP) ，是广泛应用于宫颈癌治疗的化疗药物[1]。但是，由于肿瘤细胞耐药性的存在，顺铂的治疗效果有待进一步提高。如何在不增加用药量和毒副作用的前提下，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，成为近年来研究的方向[2]。

　　5氨基酮戊酸(5aminolevulinic acid， ALA)局部给药结合可见光辐照进行光动力治疗(photodynamic therapy， ALAPDT)是近年来兴起的一种肿瘤消融新技术，已广泛应用于治疗各种体表肿瘤。ALA是一种简单的无碳化合物，是内源性化学物质，参与体内血红素的生物合成。作为血红素的前体物，ALA在ALA脱水酶等一系列酶作用下生成具有强光敏作用的原卟啉Ⅸ(protoporphyrinⅨ， PpⅨ)，它是血红素生物合成的最后一步中间体。正常情况下，血红素生物合成途径受机体负反馈机制调节，即ALA的合成受细胞内血红素含量调节，所以体内不会有过多的ALA蓄积。当给予过多的外源性ALA时，上述调节机制被打乱，机体某些增殖较快的组织或者某些肿瘤细胞即产生过量的PpⅨ，此时经激光辐照即发生光动力学反应，生成具有杀伤细胞作用的单线态氧或其他自由基等细胞毒性物质，杀伤肿瘤细胞达到治疗目的[3]。

　　Her2/neu又称cerbB2基因，其编码的蛋白质称P185cerbB2，是一种跨膜受体糖蛋白，主要定位于细胞膜，为一种具有酪氨酸激酶活性的细胞膜受体。P185cerbB2过量表达的肿瘤恶性程度高，术后易发生转移和复发，并且对化疗药物治疗具有耐药性。因此，检测P185cerbB2是否高表达，对多种肿瘤的鉴别诊断、分类预示疗效及判断预后乃至治疗方案选择均有重要意义[4]。

　　近年来，有关药物对放射治疗肿瘤起到增敏增效的研究越来越多并获得一定成果[5]。本研究通过对体外培养的人宫颈癌Hela和Siha细胞进行单纯小剂量顺铂作用、单纯光动力作用、顺铂联合光动力作用后，观察细胞增殖及调节蛋白表达的变化，探讨两种作用联合应用的增敏效应。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器 顺铂由齐鲁制药厂生产;ALA购自上海红绿光敏剂研究所;Annexin VFITC/PI购自美国Biovision公司;P185cerbB2兔单克隆抗体为美国abcam 公司产品;免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒购自北京中山金桥公司。紫外分光光度计为岛津苏州有限公司产品;荧光图像扫描分析仪为Vistra Fluorescence 公司产品;流式细胞仪为BD FACSCalibur公司产品;酶标仪为日本EYELA 公司产品;艾拉XD635AB型光动力(PDT)激光治疗仪由上海复旦张江生物医药股份有限公司生产。

　　1.2 细胞培养 人宫颈癌细胞系Hela、Siha取自山东大学齐鲁医院低温实验室。细胞培养于含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养液中，放置于37℃、50mL/L CO2、饱和湿度的培养箱中，用2.5g/L的胰蛋白酶常规传代培养。实验时用处于对数生长期的细胞。

　　1.3 照射方式及实验分组 光动力激光治疗仪的红光(波长630nm，功率300mW)经光导纤维引出后，垂直照射细胞。实验分为空白对照组、单纯顺铂治疗组(DDP)、单纯光动力治疗(PDT)组、顺铂和光动力联合治疗组，其中后者又分为先顺铂后光动力治疗组(DDPPDT)和先光动力后顺铂治疗组(PDTDDP)。

　　1.4 MTT法筛选ALA 浓度和激光能量的最佳组合参数 取处于对数生长期的Hela和Siha细胞，以5×104个/孔的密度接种于96孔培养板中，培养24h后加入用不含血清的RPMI1640培养液稀释的ALA，使其终浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2、4mmol/L。均设有单独培养液的空白对照组、单纯给药组和单纯照射组。每组3个复孔。加入ALA后在孵箱内避光培养6h，将含药液弃去，进行激光照射，激光波长630nm，由上而下垂直照射在单层细胞上，激光能量分别为1、5、 10、20J/cm2 4种照射剂量。照射完毕后，给细胞更换含有血清的RPMI1640培养液，避光培养24h。然后弃去培养液，每孔加入180μL 新鲜无血清RPMI1640培养液和20μL浓度为5mg/mL的 MTT 溶液，37℃避光孵育4h。小心吸弃孔内培养液上清， 每孔加入150μL DMSO，避光振荡10min 后，以490nm为测量波长，620nm为参考波长，在全自动酶标仪上测定各孔的吸光度值(A)，各平行孔的A值取平均数。计算细胞增殖抑制率，公式：细胞增殖抑制率= [(对照组A值-空白组A值)-(实验组A值-空白组A值)]/(对照组A值-空白组A值)×100%。采用改进寇氏法[2]计算半数抑制量( IC50)。重复3次以上，计算均值。

　　1.5 MTT法检测人宫颈癌Hela和Siha细胞对顺铂的敏感性 Hela和Siha细胞培养24h后加入用不含血清的RPMI1640培养液稀释的顺铂，使其终浓度分别为0.1、1、2.5、5、10、20mg/L。均设有单独培养液的空白对照组，每组3个复孔。在孵箱内避光培养24h，在酶标仪上测定各孔的A值，计算细胞增殖抑制率和IC50。

　　1.6 MTT法检测各组Hela和Siha细胞的增殖情况

　　DDPPDT组的Hela和Siha细胞培养24h后加入终浓度为0.1、1、2.5、5、10、20mmol/L的顺铂，孵箱内避光培养24h。去掉培养基，PBS清洗，加入1mmol/L的ALA在孵箱内避光培养6h，将含药液弃去，进行激光照射，激光波长630nm，由上而下垂直照射在单层细胞上，激光能量为5J/cm2。照射后更换为无药培养基，避光孵育24h，在全自动酶标仪上测定各孔的A值，计算细胞增殖抑制率。PDTDDP组先光动力治疗后顺铂，其余检测步骤相同。

　　1.7 免疫细胞化学法检测各组宫颈癌细胞P185cerbB2的表达 Hela、Siha细胞RPMI1640培养液常规培养，取对数生长期细胞调整浓度至5×105个/孔，接种于放有消毒盖玻片的6孔板， 37℃、50mL/L CO2孵

　　育48h 。PDT组用1mmol/L ALA和5J/cm2激光处理后孵育24h;DDP组用10mg/L顺铂处理24h;DDPPDT组先用10mg/L顺铂处理24h，再用1mmol/L ALA和5J/cm2激光处理后孵育24h;PDTDDP先用1mmol/L ALA和5J/cm2激光处理后孵育24h，再用10mg/L顺铂处理24h。处理完毕后，用丙酮溶液固定，室温干燥;用30mL/L h3O2甲醇溶液去除细胞内源性过氧化物酶活性;滴加正常羊血清封闭液室温封闭40min;弃去封闭液，用以1∶200比例稀释的一抗在湿盒内4℃过夜;滴加稀释好的生物素标记山羊抗兔IgG(二抗)37℃于湿盒内孵育30min;滴加DAB显色液，苏木素染色，用中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。实验重复3次。光学显微镜200倍放大下任选10个视野，未见阳性细胞为(-) ，阳性细胞数/100个细胞<10%为(+) ，阳性细胞数/100个细胞10%～50%为() ，阳性细胞数/100个细胞>50%为()。

　　1.8 数据资料的分析 数据在Excel和SPSS17.0中进行计算和统计。所有数据用均数±标准差表示，经正态分布和方差齐性检验后，进行单因素方差分析，方差齐的用SNK 两两比较，方差不齐的采用Tamhane两两比较，α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 不同ALA浓度和激光能量照射对宫颈癌细胞Hela和Siha增殖的影响 MTT实验结果表明，单纯激光组对两种细胞增殖均无影响(P>0.05)。在单纯光敏剂组中，当ALA<2mmol/L时对两种细胞的增殖均无影响(P>0.05)，当ALA≥2mmol/L时抑制率随药物浓度增加而明显升高(2mmol/L：Hela 6.91%， Siha 4.412%;4mmol/L：Hela 8.412%，Siha 5.154%)，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。同一激光能量组，当ALA浓度在0.1～2.0mmol/L时，抑制率随着药物浓度的增加而呈上升趋势，各浓度之间的差异有统计学意义(P<0.05);当ALA浓度在2.0～4.0mmol/L时，抑制率差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。当ALA浓度相同时，激光能量在1.0～10.0J/cm2之间随着激光能量的增加，抑制率明显增加，差异有统计学意义

　　(P<0.05)。10.0～20.0J/cm2之间抑制率上升不明显，差异无统计学意义(P>0.05，表1、表2)。表1 MTT法测定不同ALA浓度及不同光照剂量对Hela细胞增殖抑制率的影响与对照组(ALA浓度和光照剂量均为0)相比较，*P<0.05，**P<0.01。表2 MTT法测定不同ALA浓度及不同光照剂量对Siha细胞增殖抑制率的影响与对照组(ALA浓度和光照剂量均为0)相比较，*P<0.05，**P<0.01。

　　2.2 人宫颈癌Hela和Siha细胞对顺铂敏感性的影响 MTT结果显示，Hela和Siha细胞的不同浓度顺铂组与各自的对照组相比抑制率均有统计学差异(P<0.01，表3)。宫颈癌Hela细胞株比Siha细胞株对顺铂更敏感(IC50值Hela是6.83mmol/L，Siha是4.78mmol/L)，具有显著统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 比较各组Hela和Siha细胞的增殖抑制 顺铂浓度相同时，单纯顺铂组与DDPPDT组和PDTDDP组比较，差异均有统计学意义(P<0.01);DDPPDT组与PDTDDP组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。DDPPDT组和PDTDDP组与单纯光动力组(1mmol/L ALA和5J/cm2)比较，差异有统计学意义(P<0.05，图1、图2)。小剂量顺铂可明显增强光动力对Hela和Siha细胞的增殖抑制作用，但是DDPPDT组和PDTDDP组作用效果差异不明显。表3 MTT法测定不同浓度顺铂对Hela和Siha细胞的抑制率比较

　　2.4 免疫细胞化学法检测DDP组、PDT组、DDPPDT组和PDTDDP组细胞P185cerbB2的表达 阴性组是在实验过程中用PBS替换一抗过夜，其他步骤相同;对照组是未做任何处理的宫颈癌细胞，PDT组是用1mmol/L ALA和5J/cm2处理24h的宫颈癌细胞，其他条件相同。结果显示，DDP、ALAPDT和DDP与ALADDP联合均可显著抑制细胞中P185cerbB2蛋白表达，与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05，表4～5、图3～4)。两种方法联合对细胞的抑制程度均强于单纯一种方法(图3～4)。表4 P185cerbB2在宫颈癌Hela细胞中的表达表5 P185cerbB2在宫颈癌Siha细胞中的表达

　　3 讨 论

　　宫颈癌细胞对化疗药物耐药是抑制癌细胞凋亡、化疗失败的主要原因，克服耐药将成为提高进展型宫颈癌5年生存率的关键。光动力治疗突出的优点在于杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞影响较小，毒副作用轻[67]。ALA本身不具有光敏性，在一系列酶的作用下能生成具有强光敏作用的PpⅨ，不同细胞对ALAPDT的敏感性不同[89]。

　　本研究结果显示，顺铂和光动力治疗联合应用，导致细胞凋亡的程度均明显强于单一顺铂作用或光动力作用，细胞中P185cerbB2蛋白的表达下降程度也与之一致，细胞凋亡可能与P185cerbB2蛋白相关。

　　但是先顺铂后光动力治疗和先光动力后顺铂治疗相比，作用效果差异不明显。提示临床用药时，可以对耐受顺铂患者或治疗效果不明显的患者，适当搭配以光动力治疗。可以探索化疗药物与光敏剂、光照剂量之间的最佳组合参数，以获得更好的治疗效果。

　　A：阴性组;B：对照组;C：ALAPDT组;D：DDP组;E：先ALAPDT后DDP组;F：先DDP后ALAPDT组。

　　此外，还可以研究通过某种偶联物将顺铂和光敏剂特异性结合，降低毒性和副作用，提高对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。

　　总之，本实验为临床宫颈癌施行光动力治疗时，用小剂量顺铂增敏，以减少光敏剂和化疗药用量，更重要的是为未来提高光动力治疗敏感性的基因治疗提供了理论依据。

参考文献

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