IL23/IL17轴在反流性食管炎大鼠中的表达及其意义

　　　　　　作者：徐中，赵健雄，王学习，祁永福，许馨文

【摘要】 目的 检测反流性食管炎大鼠食管黏膜IL23p19、IL17表达水平的变化，探讨IL23/IL17轴在反流性食管炎发病中的作用。方法 将30只SD大鼠随机分为3组：空白组、假手术组、模型组。通过半幽门结扎联合贲门肌切开术制备反流性食管炎模型，模型制备后，各组动物继续禁食24h(但不禁水)，术后24h给予进食，继续喂养4周后处死大鼠，HE染色法观察病理变化;实时荧光定量RTPCR检测食管组织IL23p19和IL17的mRNA表达;ELISA法检测食管组织IL17蛋白的含量。结果 4周后，与正常组比较，模型组大鼠食管黏膜组织有不同程度的炎症表现。模型组食管组织IL23p19、IL17mRNA表达水平和IL17蛋白的含量明显高于正常对照组、假手术组，后两者之间无统计学差异。　结论 IL23/IL17轴是参与反流性食管炎发病的重要的细胞因子，可能参与了反流性食管炎的慢性炎症过程。

【关键词】 反流性食管炎;IL23;IL17

　　ABSTRACT: Objective To detect the expressions of interleukin17 (IL17) and interleukin23 (IL23) in esophageal tissues of rats with reflux esophagitis (RE) and explore the role of IL23/IL17 axis in the pathogenesis of RE.Methods Thirty SD rats were randomly pided into 3 groups， namely， control group， shamoperated group and model group. RE was induced by adopting partial pyloric ligation plus cardiomyotomy. Then rats in each group were fasted for 24h but had free access to water. They were fed 24h after operation. Four weeks later， rats were killed and pathological changes of esophagus mucous membrane were observed by HE staining in each group. The expressions of IL23p19 and IL17 mRNA in esophageal tissues were examined by realtime fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTFQPCR). IL17 protein content in esophageal tissues was measured by ELISA.Results After four weeks， compared with control group， model group had significant pathological changes of esophagus mucous membrane. Expressions of IL23p19 and IL17 mRNA in the esophageal tissues of model group were significantly higher than those of the other two groups; the content of IL17 protein was significant higher in model group than in the other two groups. There were no significant differences between control group and shamoperated group.Conclusion IL23/IL17 axis is an important cellular factor involved in the pathogenesis of RE and may be involved in the chronic inflammation of RE.

　　KEY WORDS: reflux esophagitis; interleukin23; interleukin17

　　反流性食管炎(reflux esophagitis， RE)是由多种原因导致的食管黏膜暴露在反流物(胃酸、胃蛋白酶、胆盐和胰酶)的作用下出现特异性症状或黏膜损伤的一种疾病。最新的国外研究[1]发现，RE食管黏膜的损害可能是由免疫介导的炎症引发的结果，而不是最初直接由酸、胃蛋白酶、胆汁造成的腐蚀性化学损伤。近来研究[24]发现，IL23/IL17炎症轴能更科学地阐明慢性炎症疾病的发病机制。该学说认为由炎症细胞产生的IL23刺激Th0细胞向一种过去不为人知的新Th细胞亚型(命名为Th17)分化，Th17细胞产生致炎性细胞因子IL17，后者具有强烈的致炎作用，从而导致多种炎症性疾病发生。IL23/IL17轴在RE发病过程中的作用尚无文献报道。本研究通过检测IL23/IL17轴在RE中的表达，探讨IL23/IL17轴在此病发病中的作用，以期对RE的发病机制和防治对策提供新的认识。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物 清洁级健康SD大鼠，雌雄各半，体质量(220±20)g。由甘肃中医学院实验动物中心提供。以上动物饲养于代谢笼中，自由摄食和饮水。

　　1.1.2 试剂 总RNA提取试剂(Trizol)购自大连宝生物有限公司，逆转录试剂盒为TaKaRa公司生产。IL17定量酶联免疫试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。戊巴比妥钠由Sigma公司生产，配制成3g/L的溶液。

　　1.1.3 主要仪器 大鼠代谢笼，Rotorgene3000荧光定量PCR仪，DJ500电子天平(常熟市衡器厂)，分析天平，722型分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司)，LG52A低速离心机(北京医用离心机厂)，恒温箱，冰箱，普通光学显微镜(OlympusVanox)，显微照相系(OlympusC35ADⅡWINDING)，计算机图像分析系统(北航)等。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 分组和喂养 30只SD大鼠运用随机数字表随机分组，设空白组、模型组、假手术组，每组10只。分笼饲养于代谢笼内，每笼4只，每组3笼，自由取食。

　　1.2.2 反流性食管炎模型的建立 参照文献许树长等[5]的方法造模(造模前24h禁食，不禁水)：应用3g/L的戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg腹腔注射)后，大鼠固定于手术台，取上腹正中切口进腹。行半幽门结扎联合贲门肌切开术：半幽门缝扎，缝扎时充分暴露幽门，用细针及细线缝扎一半幽门，并避开血管，并于食管胃交界处纵行切开贲门肌约1cm，分离至黏膜层完全暴露于视野中，以加强胃反流，后关腹。假手术组行假手术，即进腹后不进行任何手术再关腹。造模过程中因部分大鼠不能耐受实验而死亡，造模结束时，每组各留8只。

　　1.2.3 取材方法 模型制备后，各组动物继续禁食24h(但不禁水)，术后24h给予进食，各组相同条件下喂养，自由摄食、饮水，室温控制在18～22℃。继续喂养4周后处死大鼠，自胃食管交界部位向上1cm处(向咽喉方向)取一段长约1cm的食管，固定于3mol/L的福尔马林中，HE染色后光镜观察病理改变。同时取食管下段组织两部分，一部分用于制备组织匀浆并储存于-80℃备用，一部分用于进行实时PCR检查。

　　1.2.4 大鼠食管黏膜组织的病理改变 参照1999年8月全国反流性食管病研讨会制定的“反流性食管病(炎)诊断及治疗方案(试行)[6]”中反流性食管炎分级标准：鳞状上皮增生、黏膜固有层乳头延伸、上皮细胞层内炎细胞浸润为轻度;轻度基础上出现黏膜糜烂为中度;轻度基础上有溃疡形成和(或)Barrett食管改变为重度。

　　1.2.5 RealtimePCR 检测IL23p19、IL17基因的表达 引物参照GenBank序列，应用Primer Express5.0软件合成，由大连宝生物工程技术服务有限公司合成。IL23p19上游引物5′CTA AAAATAATGTGCCCCGT3′，下游引物5′AGTCCTAGTAGGAGGTGT3′，扩增片段为202bp。IL17上游引物5′CCTCAGACTACCTCAACCGT3′，下游引物5′CTTTCCCTCCGCATTGACA3′，扩增片段为129bp。βactin上游引物5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游引物5′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3′，扩增片段为150bp。荧光定量PCR仪为RotorGene3000型实时荧光定量PCR仪，用荧光染料SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行PCR扩增。采用30μL反应体系，包括2μL cDNA溶液，特异性上下游引物各0.5μL(20μmol)，SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10μL，ddh3O(灭菌蒸馏水)17μL。采用三步法PCR扩增标准程序：预变性94℃ 5min，PCR反应94℃ 20s，53℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环，历时60min。Ct值反映了模板扩增到一定量拷贝数时(处于指数上升期)所需反应循环数大小，Ct值越大，起始模板量就越小，反之则越大。阴性对照为ddh3O。荧光定量PCR结果2-△Ct数据分析法进行相对定量计算[78]。2-△Ct代表食管组织样本中IL23p19、IL17与βactin的mRNA表达水平的比值，而ΔCt=Ctspecific gene-Ctβactin。因此，ΔCt值越低表示该基因在组织中表达水平越高。

　　1.2.6 ELISA法测定食管组织IL17的含量 切取部分食管下端组织并称重，每50mg加1mL PBS(pH 6.0，内含1μL抑肽酶、亮肽素、胃酶抑素A)用剪刀剪碎在冰上用玻璃匀浆器制匀浆，4℃离心15min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL17的浓度。

　　1.2.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件，计量数据以

　　±s表示，多组间比较采用OneWay方差分析，两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠食管黏膜组织的病理改变 造模4周后正常组与假手术组食管黏膜除上皮细胞层内间或存在少量炎细胞外，无其他异常表现;模型组大鼠黏膜可见明显鳞状上皮增生，黏膜固有层乳头延伸，成纤维细胞增多，出现炎症细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主，严重者出现黏膜糜烂，多数属于中度改变(图1)。

　　2.2 各组大鼠食管组织IL23p19、IL17基因的表达 模型组食管组织IL23p19、IL17的mRNA表达水平显著高于正常对照组、假手术组(P<0.05)，后两组间指标无统计学差异(表1)。

　　2.3 各组大鼠食管组织IL17的蛋白含量 模型组食管组织中IL17的蛋白含量均显著高于正常对照组、假手术组(P<0.05)，后两组间指标无统计学差异(表1)。表1 各组大鼠食管黏膜IL23 p19、IL17表达水平的比较

　　2.4 组内各指标间的相关性分析 模型组食管组织IL23p19 mRNA基因表达的△Ct值与IL17 mRNA基因表达的△Ct值呈正相关(r=0.864)。

　　模型组IL17 mRNA基因表达的△Ct值与IL17蛋白表达水平(组织学)呈负相关(r=-0.779)。表明IL23p19 mRNA基因表达水平越高，IL17蛋白表达水平就越高。

　　3 讨 论

　　RE是一种慢性炎症性疾病，发病因素尚不十分明确，以往研究表明多种因素参与了RE的发病过程，主要包括抗返流的防御机制下降导致酸性胃液或酸性胃液加胆汁反流对食管黏膜的腐蚀作用、食管的清除能力下降、局部组织的防御能力减弱、胃排空障碍、返流物的质和量等。SOUZA等[1]研究认为，RE食管黏膜的损害可能是由免疫介导的炎症引发的结果。在RESNICK的研究[9]中，针对以往对RE患者食管上皮细胞内细胞毒淋巴细胞(CTL)的表达及细胞活性情况研究较少的问题，通过收集RE患者食管上皮组织标本，利用免疫组化方法对食管上皮细胞内CTL的表型、TLA1和颗粒酶B的表达情况进行了检测，结果证实，在RE患者的食管上皮内存在淋巴细胞的细胞毒表型和CTL的激活，从而证明在RE患者的食管上皮组织中，不仅存在淋巴细胞数目的增加，其功能状态也发生了显著变化[10]。在RE的炎症过程中，细胞因子被认为具有重要作用，以往研究发现IL1、TNFα、IL12、IL6、IL8等在RE的炎症中和病变的维持中发挥了重要的作用[1112]。

　　IL23是一种异源二聚体蛋白，是IL12细胞因子家族的成员，除了具有与IL12相同的p40亚基外，还具有特殊的p19亚基[13]。p19mRNA可见于各种组织和细胞，包括内皮细胞、髓样细胞和活化的巨噬细胞和树突状细胞等，而p40却表达受限，由于有生物活性的异二聚体的形成需要两种亚单位共同表达在同一细胞内，因而IL23主要来源于活化的巨噬细胞和树突状细胞，作为IL12家族的新成员，IL23主要作为一种前炎症细胞因子而发挥作用，还具有影响免疫反应和潜在的抗肿瘤、抗感染作用。IL23主要刺激一种以产生IL17为特点的特殊的T细胞亚单位即Th17细胞生长和存活，通过IL23/IL17轴途径发挥作用[14]。MURPHY等[15]对IL23的致病机制进行研究，发现IL23主要是通过促进炎性细胞因子IL17的分泌，致使小鼠发生炎症性疾病。IL17在多种慢性炎症中发挥了重要作用，如：类风湿性关节炎(RA)、IBD、MS、结肠炎、支气管哮喘等。IL17是促进炎症发生过程中的一种重要的可溶性因子[1618]。它的生物学作用主要包括：①IL17可通过不同的途径直接或间接作用于中性粒细胞，趋化中性粒细胞在食管中募集，促进中性粒细胞发育成熟和活化[19]。中性粒细胞在趋化、激活和吞噬过程中不仅可向吞噬溶酶体内释放产物，而且还可将产物释放到细胞外间质中，中性粒细胞释放的产物包括溶酶体酶、活性氧自由基、前列腺素和白细胞三烯。这些产物可引起内皮细胞和组织损伤，加重原始致炎因子的损伤作用。②IL17通过与上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞等间质细胞表面的IL17R结合而激活NFκB和MAPK途径。从而促使这些细胞产生复杂的前炎症细胞因子，包括IL6、TNFα、IL1β、IL8、粒细胞集落刺激因子、前列腺素E2、化学增活剂和金属蛋白酶等[16]，以及增加纤维母细胞表面细胞间黏附分子1的表达[20]，从而诱导炎症的发生。③IL17可刺激巨噬细胞聚集于局部的炎症区域，被细菌毒素或组织坏死产物或炎症介质激活后，参与炎症反应及免疫反应，可产生IL1β、TNFα、IL6，而IL6、TNFα、IL1β等能增加胶原蛋白聚集、抑制细胞外基质分解、刺激成纤维细胞的增殖，在纤维组织形成和平滑肌增生中起重要作用[2022]。④IL17可促进补体的产生[17]，C3和C5是重要的炎症介质。因此，IL17在免疫炎症性疾病的发生中有可能起到关键性的作用。目前，研究发现其与机体多种疾病相关， 特别是肺部感染、哮喘、类风湿性关节炎、器官移植、肠道炎症等炎症性疾病关系密切，但与RE的相关研究目前尚少。

　　本研究成功的复制了与人类RE相似的胃内容物反流所致的大鼠食管炎模型，实验结果显示，在RE大鼠食管组织中IL23p19和IL17 mRNA表达均较正常大鼠增高，在RE食管组织中IL17的蛋白含量均显著高于正常对照组。结合我们的实验结果可推测，IL23、IL17是参与大鼠RE发病的重要的细胞因子，以及它们所发挥的作用提示IL23/IL17轴有可能成为免疫治疗这类疾病的新靶点。

参考文献

　[1]SOUZA RF， HUO X， MITTAL V， et al. Gastroesophageal reflux might cause esophagitis through a cytokinemediated mechanism rather than caustic acid injury [J].

　　Gastroenterology， 2009， 137(5):17761784.

　　[2]IWAKURA Y， ISHIGAME H. The IL23/IL17 axis in inflammation [J]. J Clin Invest， 2006， 116(5):12181222.

　　[3]IVANOV S， BOZINOVSKI S， BOSSIOS A， et al. Functional relevance of the IL23IL17 axis in lungs in vivo [J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2007， 36(4):442451.

　　[4]KIKLY K， LIU L， NA S， et al. The IL23/Th(17) axis: therapeutic targets for autoimmune inflammation [J]. Curr Opin Immunol， 2006， 18(6):670675.

　　[5]许树长，胡运彪，莫剑忠. 大鼠十二指肠胃食管反流性食管炎 [J]. 第四军医大学学报， 2002， 23(2):155157.

　　[6]丁大洪. 反流性食管病(炎)诊断及治疗方案(试行) [J]. 中华消化内镜杂志， 1999， 16(6):326327.

　　[7]LIVAK KJ， SCHMITTGEN TD. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(Delta Delta C(T)) Method [J]. Methods， 2001， 25(4):402408.

　　[8]CALVO R， WEST J， FRANKLIN W， et al. Altered HOX and WNT7A expression in human lung cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97(23):1277612781.

　　[9]RESNICK MB， FINKELSTEIN Y， WEISSLER A， et al. Assessment and diagnostic utility of the cytotoxic Tlymphocyte phenotype using the specific markers granzymeB and TIA1 in esophageal mucosal biopsies [J]. Hum Pathol， 1999， 30(4):397402.

　　[10]李宝杰. 反流性食管炎的病理生理 [J]. 世界华人消化杂志，2000，8(10):11281130.

　　[11]NEWTON M， BURNHAM WR， KAMM MA. Speed of onset of oesophageal acid reduction with different protonpump inhibitors in patients with reflux oesophagitis [J]. Eur J Gastroenterol Hepatol， 1998， 10(9):753758.

　　[12]CUA DJ， SHERLOCK J， CHEN Y， et al. Interleukin23 rather than interleukin12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain [J]. Nature， 2003， 421(6924):744748.

　　[13]OPPMANN B， LESLEY R， BLOM B， et al. Novel p19 protein engages IL12p40 to form a cytokine， IL23， with biological activities similar as well as distinct from IL12 [J]. Immunity， 2000， 13(5):715725.

　　[14]LANGRISH CL， CHEN Y， BLUMENSCHEIN WM， et al. IL23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation [J]. J Exp Med， 2005， 201(2):233240.

　　[15]MURPHY CA， LANGRISH CL， CHEN Y， et al. pergent pro and antiinflammatory roles for IL23 and IL12 in joint autoimmune inflammation [J]. J Exp Med， 2003， 198(12):19511957.

　　[16]AGGARWAL S， GHILARDI N， XIE MH， et al. Interleukin23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin17 [J]. J Biol Chem， 2003， 278(3):19101914.

　　[17]AARVAK T， CHABAUD M， MIOSSEC P， et al. IL17 is produced by some proinflammatoryTh1/Th0 cells but not by Th3 cells [J]. J Immunol， 1999， 162(3):12461251.

　　[18]CAI L， YIN JP， STAROVASNIK MA， et al. Pathways by which interleukin 17 induces articular cartilage breakdown in vitro and in vivo [J]. Cytokine， 2001， 16(1):1021.

　　[19]CHUNG KF， BARNES PJ. Cytokines in asthma [J]. Thorax， 1999， 54(9):825857.

　　[20]YAO Z， PAINTER SL， FANSLOW WC， et al. Human IL17: a novel cytokine derived from T cells [J]. J Immunol， 1995， 155(12):54835486.

　　[21]HENNESS S， JOHNSON CK， GE Q， et al. IL17A augments TNFalphainduced IL6 expression in airway smooth muscle by enhancing mRNA stability [J]. J Allergy Clin Immunol， 2004， 114(4):958964.

　　[22]JOVANOVIC DV， DI BATTISTA JA， MARTELPELLETIER J， et al. IL17 stimulates the production and expression of proinflammatory cytokines， ILbeta and TNFalpha， by human macrophages [J]. J Immunol， 1998， 160(7):35133521.