C57/BL6小鼠海马的发育和衰老

【摘要】 目的 探讨C57/BL6小鼠海马发育及老化过程中的形态学变化规律。方法 采用光镜连续切片和体视学方法对不同发育阶段C57/BL6小鼠海马进行系统地形态学观察和定量分析。结果 E12d出现海马原基。E18d阿蒙角(CA)锥体层“C”形轮廓形成，齿状回(DG)颗粒层外臂外壳形成。出生后，CA逐渐发育成熟。　P7d DG颗粒层外壳形成。P21d DG颗粒层内外臂厚度相当，出现亚颗粒层，直到15月仍存在。海马、CA、DG、CA各层体积及DG各层体积P7d前增长缓慢，P7～P14d快速增长，P14d后增长又减缓，3月后趋稳定。结论 小鼠海马E12d发生，3月基本发育成熟。老年小鼠海马体积无明显改变。

【关键词】 小鼠;海马;发育;衰老;体视学

　　ABSTRACT:Objective To investigate the morphological changes during the development and aging of C57/BL6 mouse hippocampus.Methods Serial sections and stereology were used to quantitatively analyze the development of C57/BL6 mouse hippocampus at different growth stages.Results Hippocampus primordium first appeared at embryonic day 12 (E12d). A “C” outline could be seen in the pyramidal layer of Ammons horn (CA)， and the extraarms blanket of the dentate gyrus (DG)s granular layer formed at E18d. After birth， CA developed and maturated gradually. The blanket of DGs granular layer formed at postnatal day 7 (P7d). At P21d， the inner arms thickness of DGs granular layer was equal to that of the extraarm， and the subgranular layer was present until month 15 (15M). The increase of the volume of hippocampus， CA， DG and CAs layers was slow before P7， became fast from P7d to P14d and slowed down again after P14d， but became stable after 3M.Conclusion Mouse hippocampus is formed at E12 and becomes basically mature at month 3. The volume of aging mouse hippocampus has no obvious changes.

　　KEY WORDS: mouse; hippocampus; development; aging; stereology

　　海马(hippocampus， HI)位于侧脑室下角及内侧壁，由阿蒙角(Ammons horn， CA)、齿状回(dentate gyrus， DG)、下托(subiculum)和围绕胼胝体的海马残体(hippocampal rudiment)组成，其中CA和DG是其结构和功能最重要的区域。研究表明，海马在学习、记忆和内脏活动方面起着极其重要的作用，也与癫痫、阿尔茨海默病等神经退行性疾病密切相关。近年来，C57/BL6小鼠作为基因敲除及转基因技术的主要动物载体及人类疾病的模型动物而广为应用，但有关其海马发育的研究却主要局限于病理状态[12]，未见能够提供客观描述其发生发育及衰老过程的形态定量学依据的系统研究。本实验应用连续切片、HE染色和体视学方法系统研究C57/BL6小鼠海马主要结构及功能区域的形态学变化规律，为进一步研究海马的发育、衰老、生理及病理作用机制提供形态定量学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物培养与取材 选用成年健康C57/BL6小鼠，1∶2雌、雄同窝饲养，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄(embryonic day， E)0d，观察到仔鼠出生的当天计为生后(postnatal day， P)0d。选取胚E10、12、14、16、18、20d和P1、3、5、7、14、21、28d的仔鼠及生后2、3、6、15月的成鼠及老年鼠，每组取8只，每两只来自同窝。将孕鼠用40g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后剖腹取出胎鼠，E10、12、14d的胎鼠取全胚，其余各时间段断头取脑，40g/L多聚甲醛固定。

　　1.2 光镜标本的制作和HE染色 固定后常规脱水透明，石蜡定向包埋。制作5μm厚的连续切片，等间隔选取切片，HE染色，光镜下观察。

　　1.3 体视学测定 在10×10倍光镜下应用方格测试系统、点计数法，根据公式V总=∑A×h，测算出海马、CA及DG的体积，∑A=∑P总×a2，其中a为方格测试系统每一小格的边长，相当于实际长度0.01mm，∑P总为方格测试系统落在所选切片海马、CA及DG各自的点数和，h为所选切片之间的距离。根据公式

　　Vv=∑Px/∑Pc测出各年龄组小鼠CA与DG各层的体密度，∑Px为方格测试系统落在所选切片各层点数之和，∑Pc为方格测试系统落在参照系的点数(以海马为参照系)。根据公式V=V总×Vv计算出CA与DG各层的体积[3]。

　　1.4 统计学处理 用SPSS13.0统计软件对测量数据进行Oneway ANOVA统计分析。各分区各时间点间体积进行多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 出生前的海马形态学 E12d海马原基出现，即位于端脑泡背内侧壁处、由正中线向下延伸而形成的左右两个“S”形结构。CA神经上皮占据背侧大部分，呈内翻的弧形弯曲，其下方为DG神经上皮， 呈外翻的弧形弯曲。此时海马原基仅由复层室周神经上皮构成(图1)。

　　E14d海马原基由室周神经上皮和其内侧的边缘层构成。

　　E16d CA从内向外可分为神经上皮层、中间层、海马板(CA1区已隐约可见)与边缘层;DG可分为神经上皮层及其内侧的第二代齿状回基质(图1)。

　　E18d海马裂形成。此时CA可分为神经上皮层、海马槽、始层、锥体层(CA1与CA3区的弧形弯曲形成)、辐射层和腔隙分子层;DG可分为神经上皮层、边缘层、颗粒层和门区。颗粒层外臂可见单层排列细胞，内臂仅见起始部(图1)。

　　E20d海马裂消失，CA分子层与DG外臂分子层贴在一起(图1)。

　　2.2 出生后的海马形态学

　　2.2.1 阿蒙角 CA从海马沟至脑室面可以区分出以下3层，即多形层(室管膜、海马槽、始层)、锥体层及分子层(辐射层和腔隙分子层)。P1～P14d，上述各层变化很大。锥体层外周细胞排列成一条致密带，细胞体积较小，呈仿锤形，着色较深，与下托部和大脑皮质的这种类似的致密带相互延续。这种致密带于P1d最宽，以后逐渐变窄，至P14d消失。此后，锥体层细胞体积较大，呈锥体形，着色浅淡。分子层及多形层中细胞形态有相似渐变规律(图1)。

　　2.2.2 齿状回 DG从海马沟至脑室面可区分出分子层、颗粒细胞层和多形层3层结构，其中以颗粒层结构变化最大。P1d，颗粒层与多形层分界不清，外臂仍仅见单层排列成熟颗粒细胞(即外臂外壳)，细胞体积稍大，圆颗粒形，染色浅，内臂仅见起始部分布一群成熟颗粒细胞(即内臂外壳)。

　　A：E12，箭头所指为海马原基;B：E16，细箭头所指为阿蒙角，粗箭头所指为齿状回;C：E18;D：E20;E：P1;F：P7;G：P14;H：P21。

　　2.2 体视学测量 C57/BL6小鼠海马、CA、DG、CA各层及DG各层体积P7d前增长缓慢，P7～P14d快速增长，P14d后增长又减缓(P<0.01)，但3月后均趋稳定(P>0.05，图2～4)。

　　3 讨 论

　　ALTMAN等[4]对大鼠的研究发现CA锥体细胞的产生、迁移、定居等均于胚胎时期完成。我们对C57/BL6小鼠的研究也发现：E16d CA海马板处CA1区已隐约可见;E18d CA雏形形成，分层清晰，锥体层形成特有“C”形;生后锥体层细胞逐渐发育分化成熟。体视学结果也可推测：生前CA各层细胞迅速迁移定居;生后顺应海马功能的不断完善CA各层体积增长迅速，尤以P7～14d增长迅速;到3月CA各层体积趋于稳定，其结构与功能已基本成熟。

　　ALTMAN等[5]对大鼠的研究还发现原始DG神经上皮须经多次迁移，并相继形成二、三代齿状回生长基质及亚颗粒区后，由此作为颗粒细胞的前体细胞而演变为颗粒细胞。DG发育可分3个阶段。第一阶段是颗粒层两臂外壳形成;第二阶段是颗粒层体积增长期，即婴儿期和青少年期;第三阶段为青年期以后[6]。我们对C57/BL6小鼠的研究发现：P7d颗粒层外壳形成，P21d颗粒层内外臂长度厚度相当，符合以上三段论。体视学结果也证实P7d前DG及其各层体积增长缓慢;P7～21d为其体积增长期，尤以P7～14d为甚;P21d后为其第三阶段;至3月后各区体积趋于稳定，其结构和功能基本发育成熟。

　　大鼠E14d出现海马原基，E22d CA锥体层“C”形轮廓形成，DG颗粒层外臂外壳形成[7]。大小鼠的差别可能是由于孕期的差异(大鼠孕期约为21～22d，而C57/BL6小鼠孕期约为19～21d)，小鼠的海马发生比大鼠早，且发育速度快。

　　DRISCOLL等[8]发现老年大鼠海马体积与中年大鼠无明显差异。ADELINE等[9]

　　也发现老年恒河猴DG细胞数无减少。MIYAHIRA等[10]却发现老年人海马体积随年龄的增加而减小。我们通过体视学研究发现C57/BL6老年小鼠海马体积无明显下降趋势，但因其为15月，尚处于老年初期，故欲知其确切老年海马体积变化趋势尚需进一步研究。

参考文献

　[1]王堃，张蕊，郭敏. Nbn基因对出生后小鼠海马发育的影响 [J]. 西安交通大学学报：医学版， 2009， 30(5):536539.

　　[2]NAYLOR AS， BULL C， NILSSON MK， et al. Voluntary running rescues adult hippocampal neurogenesis after irradiation of the young mouse brain [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2008， 105(38):1463214637.

　　[3]宋小峰，张振兴，郭敏. 大鼠肾小体发生发育的形态学变化 [J]. 解剖学杂志， 2008， 31(1):3133.

　　[4]ALTMAN J， BAYER SA. Prolonged sojourn of developing pyramidal cells in the intermediate zone of the hippocampus and their settling in the stratum pyramidale [J]. J Comp Neurol， 1990， 301(3):343364.

　　[5]ALTMAN J， BAYER SA. Mosaic organization of the hippocampal neuroepithelium and the multiple germinal sources of dentate granule cells [J]. J Comp Neurol， 1990， 301(3):325342.

　　[6]席刚明，汪华侨，唐廷勇，等. 大鼠海马结构中细胞发生的时间及其迁移路线 [J]. 解剖科学进展， 1999， 5(3):199202.

　　[7]席刚明，汪华侨，唐廷勇，等. 胚胎时期大鼠海马结构的发育 [J]. 四川解剖学杂志， l999， 7(1):1621.

　　[8]DRISCOLL I， HOWARD SR， STONE JC， et al. The aging hippocampus: a multilevel analysis in the rat [J]. Neurosci， 2006， 139(4):11731185.

　　[9]ADELINE J， PAMELA B， DAVIDG A， et al. Quantitative analysis of postnatal neurogenesis and neuron number in the macaque monkey dentate gyrus [J]. Euro J Neurosci， 2010， (31):273285.

　　[10]MIYAHIRA Y， YU J， HIRAMATSU K， et al. Brain volumetric MRI study in healthy elderly persons using statistical parametric mapping [J]. Seishin Shinkeigaku Zasshi， 2004， 106(2):138151.