乌司他丁通过抑制肠黏膜细胞凋亡减轻大鼠肠道缺血再灌注损伤

【摘要】 目的 探讨蛋白酶抑制剂乌司他丁(ulinastatin， UTI)对大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜屏障功能的保护作用及其机制。　方法 24只成年雄性SD大鼠夹闭肠系膜上动脉1h，再灌注1h，随机分为空白对照组、对照组和治疗组。治疗组于缺血后经阴茎背静脉缓慢泵入UTI(5万单位/kg);对照组给予等量等渗盐水;空白对照组仅做开关腹并给予等量生理盐水作为对照。各组大鼠均于制模后采集标本，动态浊度法检测血清内毒素含量，TUNEL法检测肠黏膜上皮细胞凋亡率，RTPCR检测凋亡调控基因Bax、Bcl2 mRNA的表达。结果 空白对照组血清内毒素水平和肠黏膜细胞凋亡指数均低于对照组(P<0.01);治疗组Bax mRNA表达低于对照组(P<0.01)，而Bcl2 mRNA表达高于对照组(P<0.01)。结论 乌司他丁可能通过抑制肠黏膜上皮细胞的凋亡，维持肠黏膜屏障的完整性，从而防止缺血再灌注损伤时细菌和内毒素的移居。

【关键词】 乌司他丁;肠缺血再灌注损伤;细胞凋亡;Bax;Bcl2

　　ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of ulinastatin on the intestinal mucosal barrier in rats with ischemiareperfusion.Methods Totally 24 SD rats were randomly pided into 3 groups after clamping superiormesenteric artery for 1h and reperfusion for 1h: blank control group， control group and treatment group. Rats in the treatment group were injected with ulinastatin (50000U/kg) through vena dorsalis penis after ischemiareperfusion model was induced. The control group underwent laparotomy with only the manipulation of the intestine and the same dose of saline was used through the same way. Specimens were obtained after ischemiareperfusion model was induced. Dynamic turbidimetry was used to evaluate the effect of ulinastatin on the intestinal endotoxin translocation in rats. Apoptosis of mucosal cells was detected by TUNEL method， and the expressions of Bax and Bcl2 mRNA were determined by semiquantitative RTPCR.　Results The serum endotoxin level and apoptotic index of mucosal cells were evidently lower in blank control group than in control group (P<0.01). The expression of Bax mRNA in intestinal mucosal cells was lower in treatment group than in control group (P<0.01)， but the expression of Bcl2 mRNA was lower in treatment group (P<0.01).　Conclusion Ulinastatin can prevent the translocation of bacteria and endotoxin in ischemiareperfusion injury by inhibiting the apoptosis of intestinal mucosa cells and maintaining the intestinal barrier function.

　　KEY WORDS: ulinastatin; ischemiareperfusion; cell apoptosis; Bax; Bcl2

　　肠道缺血再灌注( ischemiareperfusion， I/R)损伤引起的大量氧自由基释放是肠黏膜屏障损伤的重要原因。研究证实，在I/R状态下，肠黏膜因缺血、缺氧、炎症介质和细胞因子等因素而发生损伤，肠道内细菌及毒素可经受损的肠黏膜屏障发生移位，从而引起其他继发感染和多器官功能不全综合征(MODS)。

　　肠黏膜上皮屏障功能的维持依赖于上皮细胞增殖与凋亡之间的平衡。I/R损伤和细菌感染等因素可促使黏膜上皮细胞凋亡明显上调，导致肠黏膜上皮屏障(IBF)功能障碍。乌司他丁(ulinastatin， UTI)在治疗胰腺炎及抗肿瘤、抗休克等方面的作用已受到重视[13]，而其对抗肠I/R损伤的作用，尤其是其治疗机制还没有相关报道。本研究拟从细胞凋亡角度探讨UTI对大鼠肠I/R的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠24只，体重250～300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司);细胞凋亡原位检测(TUNEL)试剂盒(华美生物工程公司);PCR试剂盒(Fermentas);引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2 实验分组及模型制备 24只成年雄性健康SD大鼠，随机分为空白对照组、对照组、乌司他丁治疗组，每组8只。大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠(1.2mg/kg)腹腔注射麻醉。采用肠系膜上动脉(superior mesenteric artery， SMA)以夹闭松夹方式复制肠I/R模型，备皮消毒后取腹正中切口3～4cm，游离肠系膜上动脉，用无损伤血管夹夹闭其起始部1h，造成肠缺血模型。治疗组于缺血后立即阴茎背静脉泵输注UTI(5万单位/kg);对照组则输注等量等渗盐水，空白对照组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁并于阴茎背静脉注射等量生理盐水。大鼠均于再灌注后1h剖杀，取回肠末端距回盲部1cm处的回肠组织，40g/L多聚甲醛溶液固定。

　　1.3 动态浊度法检测门静脉血清内毒素的含量 取门静脉血清0.05mL，加入装有0.45mL样品处理液B中，混匀后70℃保温10min，取出后立刻放入冰水浴中，即为待测血清样品。取待测血清0.2mL直接加入酶反应主剂A中，溶解后使用微量加样器转移至10mm×75mm标准玻璃反应管中，插入MB80微生物快速动态检测系统中进行反应，反应结束后自动计算出待测血清中的内毒素含量。

　　1.4 回肠组织的病理学观察和细胞凋亡检测 回肠组织经40g/L多聚甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋切片(5μm)，HE染色，光镜下观察肠组织的病理学改变。DNA末端原位标记法(TUNEL)：回肠组织常规石蜡切片(5μm)，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，按照试剂盒说明书进行操作。光镜下计算凋亡指数(apoptosis index， AI)。AI的计算方法：计数4～5个高倍视野(细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞)，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

　　1.5 肠黏膜细胞RNA的提取及RTPCR检测 用Trizol试剂提取肠黏膜细胞中的总RNA，测定A260/A280，计算RNA浓度。取RNA 2μg，逆转录合成cDNA链，再以逆转录反应液2μL作为模板，用PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件：94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环;72℃延伸8min终止反应。扩增产物用1.5g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影。检测指标为凋亡调控基因Bax和Bcl2，以βactin作为内参照。

　　Bax引物序列为：上游5′TCCAGGATCGAGCAGA3′，下游5′AAGTAGAAGAGGGCAACC3′(256bp);Bcl2引物序列为：上游5′CTGGTGGACAACATCGCTCTG3′，下游5′GGTCTGCTGACCTCACTTGTG3′(228bp);内参照βactin序列为：上游5′ATTGTAACCAACTGGGACG3′，下游5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′(533bp)。

　　1.6 统计学方法 应用SPSS13.0软件包进行数据分析。结果用均数±标准差(±s)表示。组间比较采用方差分析和q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠回肠组织的病理学改变 空白对照组无明显的病理学改变;对照组小肠黏膜部分绒毛上皮脱落，黏膜下水肿充血，隐窝及肌层轻度水肿，大量炎细胞浸润(图1A);治疗组(图1B)小肠组织的病理改变均较对照组明显减轻。

　　2.2 各组大鼠血清内毒素含量的检测结果 对照组大鼠门静脉血清的内毒素含量较空白对照组明显增加(P<0.01)，治疗组内毒素含量则明显低于对照组(P<0.01，表1)。

　　2.3 各组大鼠肠黏膜细胞的凋亡情况 对照组可见较多的凋亡上皮细胞(图2A)。凋亡指数较治疗组(图2B)增高(P<0.01，表1)。

　　2.4 肠黏膜细胞Bax和Bcl2 mRNA表达的变化 凝胶电泳结果显示，Bcl2、Bax和βactin的PCR扩增片段的大小分别与预期值相符。在空白对照组，肠黏膜细胞Bcl2 mRNA和Bax mRNA的表达相对较低或不表达;对照组组Bcl2 mRNA(图3A)的表达水平稍有上升，Bax mRNA(图3B)的表达水平明显上升(P<0.01);治疗组Bcl2 mRNA的表达水平明显上升，Bax mRNA的表达水平明显下降(P<0.01，表1)。表1 大鼠血清内毒素含量、肠黏膜细胞凋亡及Bax、Bcl2 mRNA的表达情况

　　3 讨 论

　　I/R损伤引起的大量氧自由基释放是肠黏膜屏障损伤的重要原因。I/R时富含黄嘌呤氧化酶的肠上皮细胞将产生大量氧自由基引发脂质过氧化，抑制线粒体酶活性，破坏肠黏膜细胞的结构和功能。肠黏膜通透性增高导致内毒素移位，肠腔内毒素通过损伤的肠黏膜入血，血中内毒素水平上升。肠腔内大量细菌入侵或内毒素移位则可进一步通过增敏系统诱发全身性炎症反应，最终造成多器官功能损害甚至衰竭。

　　既往对于细胞凋亡和凋亡相关基因的研究表明，凋亡失调参与了病理状况下肠黏膜的病变过程。

　　I/R大鼠肠黏膜屏障受损表现为肠黏膜形态学的改变、通透性的增高，以及内毒素和肠道细菌的移位。本研究结果显示，治疗组和空白对照组组大鼠均存在频率较低的肠黏膜上皮细胞凋亡;对照组则存在明显的细胞凋亡上调。内毒素检测结果显示，对照组血清内毒素水平明显高于治疗组，提示I/R时肠黏膜通透性明显增高。因此，推测细胞凋亡的上调是I/R早期肠黏膜屏障功能障碍的一个重要的分子生物学基础。

　　已知多个基因参与了细胞凋亡调控，其中，Bcl2和Bax分别是经典的抑制凋亡成员和促进凋亡成员。促凋亡基因Bax与Bcl2结构类似，与Bcl2结合，阻止Bcl2的激活，从而促进凋亡。Bcl2家族调节细胞凋亡主要通过线粒体途径。Bcl2家族蛋白成员精确地改变线粒体膜的通透性，造成线粒体膜电位下降。而线粒体膜电位降低则是发生细胞凋亡的早期事件[4]。本研究发现，建立大鼠I/R模型后，治疗组Bax基因mRNA表达明显减弱而Bcl2 mRNA表达明显增强，其变化规律与肠黏膜上皮细胞凋亡的规律相同。

　　UTI是来源于人尿的酸性糖蛋白，具有稳定溶酶体和细胞膜及调控炎性介质和氧自由基释放作用。其主要作用机制包括：①抑制脂多糖(LPS)刺激单核细胞产生强烈的缩血管活性物质血栓烷A2(TXA2)和其代谢产物B2(TXB2)的合成[1];抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激血管内皮细胞间黏附分子1(ICAM1)的表达[3]，而后者可介导白细胞与血管内皮细胞间的黏附及白细胞向血管外游走，导致微循环栓塞和加重组织缺血、缺氧损伤。由于TXA2和ICAM1生成减少，从而有益于微循环状况的改善。②稳定溶酶体膜和细胞膜，抑制中性粒细胞活性及其与血管内皮细胞间的黏附和向血管外游走，从而抑制其释放具有细胞毒性的氧自由基和(或)蛋白酶，减轻中性粒细胞介导的缺血再灌注损伤[3]。③抑制TNFα、IL1、IL6、IL8产生，抑制过度炎性反应的损害。

　　本研究结果表明，UTI在治疗大鼠I/R过程中具有较明显的保护肠黏膜上皮屏障的作用。下调Bax基因和上调Bcl2基因的表达，从而抑制肠黏膜细胞凋亡可能是其作用机制之一。但是，其对肠黏膜保护作用的机制是通过以上述途径还是其他通路尚有待于进一步研究。

参考文献

　[1]张伟，朱维铭，李宁. 乌司他丁对肠缺血再灌注大鼠肠黏膜屏障的影响 [J]. 医学研究生学报， 2006， 19(6):526529.

　　[2]张小桥，范西红，陈英剑. 乌司他丁对移植小肠缺血再灌注损伤保护机制的研究 [J]. 中华普通外科杂志， 2006， 21(1):7374.

　　[3]王毓利，乔海泉，佟立权. 乌司他丁对大鼠肝脏缺血再灌注后多器官损伤的保护作用 [J]. 哈尔滨医科大学学报， 2007， 41(4):296298.

　　[4]HAO Z， GORDORN S， CAN D， et al. Specific ablation of the apoptotic functions of cytochrome c reveals a differential requirement for cytochrome c and apaf1 in apoptosis [J]. Cell， 2005， 121(4):579591.

　　[5]张欢，乔青，杨拔贤. 乌司他丁对原位肝移植术患者围术期促炎性细胞因子和氧自由基代谢的影响 [J]. 中华麻醉学杂志， 2003; 23(5):325327.