非CO2依赖型细胞培养系统对前列腺癌PC3细胞增殖的影响

【摘要】 目的 探讨非CO2依赖型细胞培养系统对前列腺癌PC3细胞增殖的影响。方法 对前列腺癌PC3细胞采取非CO2依赖型细胞培养系统及CO2依赖型细胞培养系统进行培养，均在37℃培养箱(大气环境)和37℃，50mL/L CO2培养箱条件下，检测分析两种体系pH的变化;采用细胞增殖曲线及克隆形成实验检测细胞生长差异情况;并使用RTPCR技术检测分析两种体系下的前列腺癌细胞中survivin、caspase3基因的表达差异。结果 两种培养系统条件下，细胞培养基pH变化趋势一致(P>0.05);两种培养系统下PC3细胞生长增殖未见差异(P>0.05);RTPCR法检测显示两种培养系统下表达survivin、caspase3未见差异(P>0.05)。结论 前列腺癌非CO2依赖型细胞培养系统对细胞增殖、基因表达等方面与前列腺癌CO2依赖型细胞培养系统无显著差异。

【关键词】 PC3前列腺癌细胞;非CO2依赖;survivin;caspase3

　　Methods Prostate carcinoma cell line PC3 was cultured using　CO2independent culture cell system and CO2dependent culture cell system at 37℃ in 50mL/L carbon dioxide incubator and at 37℃ in air incubator. The pH of culture medium with the two culture cell systems was detected. Differences in cell viability were assayed with CCK8 test and colony forming assay. The expressions of survivin and caspase3 mRNA of cell culturing with the two systems were detected by RTPCR assay.　Results Under the two culture cell systems， the pH trend was the same (P>0.05)， PC3 cell proliferation and the expressions of survivin and caspase3 mRNA of the cell had no obvious differences (P>0.05).Conclusion CO2independent culture cell system is parallel to CO2dependent culture cell system in their effects on cell proliferation and gene expression.

　　KEY WORDS: PC3 prostate carcinoma cell; CO2independent; surviving; caspase3

　　前列腺癌(prostate carcinoma， PC)是男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤。目前，我国临床发现的前列腺癌有逐年上升的趋势[1]。20世纪90年代我国前列腺癌的发病率较50年代增长了近5倍[2]。其治疗方法包括前列腺切除术、内分泌治疗等，但其预后欠佳。

　　而近年来，以抗肿瘤药物个体化治疗为目的的抗肿瘤药物敏感性试验愈来愈受到重视，王共先等[3]探讨了前列腺癌细胞的原代和传代培养的方法;张勇等[4]曾对激素难治性前列腺癌细胞进行化疗药物敏感性比较。但是，这些研究均基于CO2依赖型细胞培养系统。它不仅需配备CO2培养箱及相关设备，耗费多，而且对操作人员技术水平要求高，不便于该试验的普及推广。而非CO2依赖型细胞培养系统(专利申请中)不仅不需要CO2培养箱，可节省资金，而且操作方便，可以为众多的科研人员提供一种新的选择。目前，对前列腺癌细胞采取非CO2依赖型细胞培养系统及在此基础上进行前列腺癌个体化药敏试验国内未见报道。这已经成为体外药敏试验在临床广泛应用必须迫切突破的瓶颈。本研究旨在探讨非CO2依赖型肿瘤细胞培养系统对PC3细胞增殖的影响及其与CO2依赖型肿瘤细胞培养系统有无差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 人激素难治性前列腺癌细胞株PC3

　　(中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)，DMEM培养液(GIBCO公司)，培养基配制按GIBCO公司说明书，非CO2依赖型细胞培养基的配制为DMEM培养液加入某些成分(专利申请中)后调至pH值约7.4。小牛血清(GIBCO公司)，RTPCR反应体系(Promega公司)。CCK8试剂(大连宝生物有限公司)，caspase3 mRNA及survivin mRNA引物由上海赛百盛生物技术有限责任公司合成。

　　1.2 实验分组 共分为4组，即：37℃培养箱、大气环境下CO2依赖型细胞培养(大气 A)组，37℃培养箱、大气环境下非CO2依赖型细胞培养组(大气B)，37℃(50mL/L，CO2)培养箱CO2依赖型细胞培养(CO2A)组，37℃

　　(50mL/L，CO2)培养箱非CO2依赖型细胞培养(CO2B)组。

　　1.3 细胞培养 PC3细胞均用含100mL/L胎牛血清(FBS)、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基，在37℃培养箱、大气环境下和37℃(50mL/L，CO2)培养箱中培养，实验用细胞为接种后24h的对数生长期细胞。

　　1.4 两种系统培养基pH值的测定 将两种系统培养基分别置于37℃培养箱、大气环境中和37℃(50mL/L，CO2)培养箱中培养，24h后开始测定pH值，连测7d并记录数值。

　　1.5 克隆形成后的计数 取对数生长期细胞用2.5mL/L胰蛋白酶消化，用CO2依赖型细胞培养基和非CO2依赖型细胞培养基配成单个细胞，以1500个/孔细胞接种于6孔培养板中，每孔体积2mL培养基。分别置于37℃培养箱、大气环境中和37℃、50mL/L CO2培养箱中进行培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇5mL，固定15min。然后去固定液，加适量Giemsa/结晶紫应用染色液染10～30min，后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，在低倍显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。

　　1.6 细胞增殖曲线的绘制 使用上述两种培养基在96孔板中接种1.5×103/孔的细胞，每孔体积200μL，连续培养7d。用MTS法绘制细胞生长曲线。每孔加入10μL CCK8液，分别在37℃培养箱、大气环境中和37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，2h后吸出上清，用Model550 ELISA plate reader读取450nm的吸光度。活细胞的数量与吸光度成正比。

　　1.7 流式细胞仪检测细胞的凋亡率及对细胞周期的影响 用上述两种培养基置10cm皿中培养细胞，分别在37℃培养箱、大气环境中和37℃、50mL/L CO2培养箱中进行培养。24h贴壁后收集细胞，制成单细胞悬液，700mL/L乙醇固定，4℃保存过夜，-20℃保存(有效期为1周)。检测前用PBS洗去固定液，加入20μL RnaseA，37℃孵育30min后，暗处加PI染液，冰浴30min，染色后以300目筛网过滤。调整细胞浓度为

　　1×105～1×106/mL，上流式细胞仪检测，激发光源为氩离子，激发波长488nm，用Multicycle DNA分析软件行细胞周期的测定。

　　1.8 Survivin、caspase3的测定 取对数生长期PC3细胞按大气A组、大气B组、CO2A组、CO2B组分别孵育24、48h后，使用Trizol试剂按照一步法抽提各组细胞株的总RNA，取5μL RNA稀释10倍分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的吸光度值(A)，并计算RNA的含量和纯度。以1μL总RNA为模板，20μL体系进行逆转录合成cDNA。将合成的cDNA稀释20倍后进行PCR扩增，caspase3 mRNA上游引物：5′TGACCGAGGCTACATTCA

　　GATGACACC3′，下游引物：5′CAAGAGAGTTG

　　GGCTGACCAGAAACAC3′，扩增产物365bp;survivin mRNA上游引物：5′CCCTTTCTCAAGGAC

　　CACCGCATC3′，下游引物：5′CACTGAGAACG

　　AGCCAGACTTGGC3′扩增产物

　　133bp;βactin上游引物：5′AGTGTGACGTGGACATCCGCA3′，下游引物：5′ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′，扩增产物243bp。加入survivin上下游引物各

　　0.25μL、caspase3上下游引物各0.25μL，取5μL PCR产物于25g/L琼脂糖凝胶电泳来分析结果，以DNA Marker来指示大小。

　　1.9 统计学处理 所有实验均重复3次，用±s表示。应用SPSS 11.0软件进行统计学处理，重复测量的方差分析采用F检验。P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 培养基pH值的比较 CO2A组、CO2B组、大气A组、大气B组的pH值见图1。大气B组与CO2A组和CO2B组pH值未见显著性差异(P>0.05)，大气A组与CO2A组、CO2B组pH值有显著性差异(P<0.05)。

　　图1 不同组培养基连续7d 的pH值的测定

　　Fig.1 Testing of 7day pH value in culture medium of different groups

　　2.2 克隆数的比较 CO2A组、CO2B组、大气A组和大气B组的肉眼克隆见图2。大气B组(373±10)与CO2A组(352±11)和CO2B(362±11)组未见显著性差异(P>0.05)，大气A组(58±5)与CO2A组、CO2B组有显著性差异(P<0.05)。

　　2.3 增殖曲线的比较 由图3可知，CO2A组和CO2B组均与大气B组细胞增殖无显著变化，差异不具有显著性(P>0.05);大气A组与各组相比细胞增殖显著下降，具有显著性差异(P<0.05)。

　　2.4 细胞周期及凋亡率的比较 细胞凋亡数随着作用时间的延长而增加，大气A组更加明显。CO2A组与大气B组凋亡率无显著变化，差异不具有显著性(P>0.05);大气A组与各组相比凋亡率显著升高，具有显著性差异(P<0.05，表1、图4)。表1 不同组培养细胞24、48h后对PC3细胞周期分布及细胞凋亡率的影响

　　2.5 Survivin、caspase3因子表达的比较 不同组培养细胞24、48h后提取总RNA，逆转录后进行RTPCR，结果显示：大气B组与CO2A组、CO2B组表达survivin、caspase3未见明显变化。随着培养时间的延长，大气A组caspase3表达增高，survivin mRNA的表达并未明显变化(图5、图6)。

　　3 讨 论

　　大多数细胞系在pH值7.4生长最好，不同细胞株之间差别不大。但是，一些正常成纤维细胞系在pH 7.4～7.7生长最好，而一些转化细胞可能在pH 7.0～7.4生长的会更好些[5]。据报道上皮细胞可以维持在pH 5.5[67]。

　　一般CO2依赖型细胞培养系统中培养基的pH在7.0～7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统(人体血液中最重要的pH缓冲系统)。

　　所以，大多数培养液用它来维持稳定的pH。为了维持稳定的pH，培养箱中的CO2需要维持在20～100mL/L之间，以保持培养液中溶解的CO2的浓度。

　　由于空气中的CO2浓度很低，如果细胞不在CO2培养箱中培养，培养液中的HCO-3会被耗尽，这样会影响细胞的正常生长，甚至导致细胞死亡。所以，大部分细胞的培养，还是需要CO2培养箱。而CO2非依赖型细胞培养系统的培养基中某些成分也可使pH值稳定在7.4左右，维持弱碱环境，达到与普通培养基一样的效果，有利于细胞株的生长。大气B组与CO2A组pH值比较无显著性差异(P>0.05)即可证明。而CO2依赖型细胞培养系统在37℃培养箱(大气环境)的效果明显差于非CO2依赖型细胞培养系统在37℃培养箱(大气环境)的效果。

　　Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins， IAPs)中结构独特的新成员，于1997年由耶鲁大学ALTIERI等[8]用效应细胞蛋白酶受体1(effecter cell protease receptor1， EPR1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来。它可直接抑制末端效应器caspase3和caspase7并干扰caspase9的活性，阻止细胞凋亡[9]。而survivin基因在恶性肿瘤中的高表达与肿瘤的凋亡抗性密切相关。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族，caspase家族在细胞凋亡信号传导过程中起到核心作用。例如，caspase3在凋亡途径处于下游，是细胞凋亡的关键信号酶[10]。凋亡的三种途径最后汇聚到同一通路，均切割激活caspase3，最终致细胞凋亡[11]。因此，检测caspase3的活性有助于发现早期的凋亡细胞[12]。本实验结果显示大气B组与CO2A组、CO2B组表达survivin、caspase3未见明显变化，而随着培养时间的延长，大气A组可使caspase3表达水平相应升高，survivin mRNA表达水平未见明显变化。从而，证明了非CO2依赖型细胞培养体系在大气环境下减缓细胞凋亡的速率同CO2依赖型细胞培养体系无显著差别。

　　综上所述，非CO2依赖型肿瘤细胞培养系统对PC3细胞增殖与CO2依赖型肿瘤细胞培养系统并无差异。而传统的CO2依赖型细胞培养系统不仅需

　　要CO2培养箱(价格昂贵)，而且对于操作人员技术要求高，步骤繁琐。本系统的应用不仅不需要CO2培养箱，而且节省资金，操作方便，可以为众多的科研人员提供一种新的选择。另外，本实验将为该套系统的应用积累相关经验，并为该套系统的规模化推广奠定基础。同时，亦将有助于突破体外药敏试验的瓶颈，促进体外药敏试验的实用性及准确性的提高，使肿瘤患者的个体化治疗逐渐成为现实。

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