COX2、VEGF在腹腔粘连组织中的表达及其意义

　　 作者：贾宗良，平高峰，王康，李徐奇，魏光兵，徐昕，段红亮　　

【摘要】 目的 探讨COX2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)在人体腹腔粘连组织中的表达及其与腹腔粘连发生发展生物学行为的关系。方法 收集40例二次手术患者的粘连组织和20例初次手术患者的正常腹膜组织标本，采用免疫组化方法检测粘连组织COX2、VEGF及微血管密度(microvessel density， MVD)的表达情况并作相关分析。结果 COX2、VEGF、MVD在粘连组织中的阳性表达显著高于正常腹膜组织(P<0.05);COX2表达与腹腔粘连程度相关(P<0.05);VEGF表达与腹腔粘连程度及二次手术时间间隔相关(P<0.05);COX2、VEGF、MVD呈两两正相关。结论 COX2、VEGF参与人体术后腹腔粘连的发生、发展，可能与COX2介导的上调VEGF表达等途径促进粘连组织血管生成有关，可作为粘连形成机制中血管发生的重要生物学指标。

【关键词】 腹腔粘连;COX2;VEGF;血管生成

　　ABSTRACT: Objective To evaluate the expression of cyclooxygenase2 (COX2) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in human abdominal adhesion tissues and investigate its correlation with biological behavior of abdominal adhesion occurrence and development.Methods We collected 40 abdominal adhesion tissue samples from second abdomen surgery and 20 normal abdominal tissue samples from primary abdomen surgery as controls. Expressions of COX2， VEGF and microvessel density (MVD) of the adhesion tissues were evaluated by immunohistochemical method.Results The positive expression rates of COX2， VEGF and MVD were significantly higher in the adhesion tissues than in the normal abdominal tissues (P<0.05); COX2 expression had a significant correlation with the degree of adhesion (P<0.05). The expression of VEGF had a significant correlation with the degree of adhesion and the interval between the two operations (P<0.05). There was a positive correlation among COX2， VEGF and MVD.Conclusion COX2 and VEGF are involved in the occurrence and development of postoperative abdominal adhesion; COX2s involvement in adhesion occurrence may be related to the promotion of angiogenesis in adhesion tissues through such pathways as COX2mediated upregulation of VEGF. Therefore， COX2 and VEGF may be used as important biological indicators of angiogenesis in the mechanism of adhesion formation.

　　KEY WORDS: abdominal adhesion; cyclooxygenase2 (COX2); vascular endothelial growth factor (VEGF); angiogenesis

　　术后腹腔粘连是外科剖腹术后最常见的并发症，常导致术后腹部不适或持续疼痛、粘连性肠梗阻和不育症等一系列严重且危险的并发症，且很难通过再次手术加以改善[13]。虽然目前临床有不少防治粘连的措施，但收效有限。而腹腔粘连的形成机制复杂，至今仍无统一认识。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)是目前所知作用最强、选择性最高的促血管生成因子，而环氧合酶2(cyclooxygenase2， COX2)的过表达可明显上调VEGF等促血管生成因子，从而促进血管生成。国外已有一些研究开始关注腹膜粘连形成过程中与血管生成的关系，但相关研究较少。本实验采用免疫组化方法检测粘连组织COX2、VEGF及MVD的表达情况及其相关性，探索COX2、VEGF在粘连组织中的表达及与血管生成的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 标本选自西安交通大学医学院第一附属医院2008年1月至2008年9月间资料齐全的开腹手术患者，其中40例二次手术患者的粘连组织，20例初次手术患者的正常腹膜组织。本研究病例中男28例，女32例，年龄26～69岁，平均年龄49.7岁，≥60岁16例，<60岁44例。其中40例粘连组病例中，男19例，女21例，年龄28～69岁，平均年龄51.8岁，≥60岁14例，<60岁26例;两次手术间隔时间>1年者19例，≤1年者21例;曾使用过防粘连剂者15例，未使用者25例;粘连严重程度按修正KATADA ET AL[4]粘连评分及Nair五级分类法[5]分为轻重两组：较轻组7例，严重组33例。

　　1.2 主要试剂和染色方法 COX2(兔抗人单克隆抗体)、VEGF(鼠抗人单克隆抗体)、CD34(鼠抗人单克隆抗体)购自Santa Cruz生物技术公司，SP试剂盒、DAB试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。采用免疫组化SP法，具体操作按SP试剂盒说明进行，阳性对照为试剂生产公司提供的阳性切片，另用PBS代替一抗为空白对照。

　　1.3 结果判断标准 COX2蛋白阳性表达主要定位在胞浆或胞核内，呈棕黄色或黄色的颗粒状物质;VEGF蛋白阳性表达主要定位在胞浆或胞膜上，呈棕黄色或黄色的颗粒状物质;用双盲法[67]根据阳性细胞所占比例及相应染色强度评分。其中根据阳性细胞所占百分比，分别计为0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%);阳性细胞染色强度分为0～3级，阴性(无染色)为0分，弱阳性(淡黄色)为1分，中等强度(棕黄色)为2分，强阳性(黄褐色)为3分。以上两种评分之和作为最后的免疫组化评分，积分≤2视作低表达，>2视作高表达。CD34阳性表达主要定位于血管内皮细胞的胞膜或胞浆中，呈现棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇团，其代表微血管密度(microvessel density， MVD)。按WEIDNER等[8]报道的计数方法，首先在低倍镜(×100)下扫视整个切片，以染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数，肌层较厚或管腔直径大于8个红细胞直径的血管不计数，寻找3个血管密度最高的区域(即所谓“热点”)，然后在200倍视野范围分别计数每个区域的微血管数，取其平均值。

　　1.4 统计学方法 COX2、VEGF蛋白阳性率的表达及在各临床参数之间表达差异的比较采用卡方检验和确切概率法，MVD的比较采用t检验，相关分析采用直线相关分析和t检验。所有统计学处理均采用SPSS13.0软件包进行，以P<0.05为有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 COX2、VEGF及MVD在粘连组织和正常腹膜组织中的表达及与临床特征的关系 COX2、VEGF在粘连组织中的阳性高表达率分别为72.5%(29/40)、65.0%(26/40)，明显高于正常腹膜组织(P<0.05);MVD在粘连组织和正常腹膜组织中分别为25.66±6.91、13.47±4.43，两者比较有显著性差异(P<0.01);

　　COX2的表达与患者的性别、年龄、防粘连剂的使用及二次手术时间间隔上无显著性差异，而与粘连程度相关(P<0.05)，即随着粘连程度加重而增高;VEGF的表达与患者的性别、年龄及防粘连剂的使用无显著性差异，而与粘连程度及二次手术时间间隔相关(P<0.05)，即随着粘连程度加重及手术时间间隔缩短而增高;MVD表达与患者的性别、年龄及防粘连剂的使用无显著性差异，而与粘连程度及二次手术时间间隔相关(P<0.05)，即随着粘连程度加重及手术时间间隔缩短而增高(表1、图1)。

　　2.2 COX2、VEGF及MVD在粘连组织中两两联合表达的关系 在粘连组40例中，COX2高表达的29例中VEGF高表达24例，其余5例低表达;在COX2低表达的11例中VEGF低表达9例，其余2例高表达;经直线相关性分析两者呈正相关(r>0，P<0.01)，即COX2高表达的组织VEGF大部分也呈现高表达趋势。COX2高表达的29例中MVD值为27.45±5.90，而COX2低表达的11例中MVD值为20.94±7.41，两者具有显著性差异(P<0.01)，经直线相关性分析两者呈正相关(r>0，P<0.01)，即COX2高表达的组织MVD呈现高表达趋势。在VEGF高表达的26例中，MVD值为28.77±5.12，而VEGF低表达的14例中MVD值为19.88±6.12，两者具有显著性差异(P<0.01)，经直线相关性分析两者呈正相关(r>0，P<0.01)，即VEGF高表达的组织MVD呈现高表达趋势。表1 COX2、VEGF及MVD在粘连组织中的表达及与临床特征的关系

　　3 讨 论

　　腹腔粘连是腹部外科手术后最常见并发症，亦是近年来外科领域研究和争论较多的一个课题。国内外对腹腔粘连的研究在不断深入，因其形成过程十分复杂，其发生的确切机制目前尚不完全清楚。现已有一些研究开始关注腹腔粘连形成过程中与血管生成的关系，因为粘连形成过程类似于所有类型的创伤愈合，依赖于血管发生[9]。ROY等[10]在研究动物腹腔粘连模型中发现，在腹膜损伤处有大量炎细胞聚集和VEGF表达，并促进大量成熟和非成熟的新生血管生成。提示腹腔粘连组织并非过去普遍认为的无功能瘢痕组织，而是一种包含炎症细胞、氧化剂和血管生成因子的高度细胞化、血管化的有活力结构。BIGATTI等[11]研究发现血管增生与粘连类型及粘连程度之间关系密切。因此认为粘连组织形成的意义可能在于为初始损伤而导致缺血的腹膜部位供血供氧，从而促进组织创伤修复，最终导致腹腔粘连形成。

　　环氧合酶(COXs)是催化花生四烯酸转化为前列腺素初始步骤的关键限速酶，而诱导型COX2为今年来的一个研究热点。有研究发现，来自粘连组织的成纤维细胞高表达COX2 mRNA和COX2酶蛋白而来自非粘连区域的成纤维细胞则低表达甚至不表达[12]。有报道指出，在体外培养的人类成纤维母细胞中，PGE2可使VEGF表达上调[13]。而VEGF是目前公认最强、研究较成熟的一种促血管生长因子。ROUT等[14]研究发现，粘连组织中VEGF mRNA与VEGF蛋白较正常组织高表达，提示VEGF参与了粘连形成。有研究表明，COX2调节促血管生成因子这一重要功能可能系通过前列腺素途径促进VEGF的表达[15]。同时，COX2与VEGF之间可形成一个正反馈网络调节机制，协同刺激血管生成[16]。

　　本研究结果显示COX2、VEGF在粘连组织中的表达明显高于正常腹膜组织，并且与粘连程度存在相关性，随着粘连程度增加而表达加强，说明其参与了粘连的形成，在粘连的发生发展中起着重要的作用。鉴于COX2、VEGF与血管生成的密切关系，我们同时研究了COX2、VEGF和MVD在粘连组织中的表达及相关性，发现COX2高表达组较COX2低表达组的VEGF表达和MVD值明显增高，均存在统计学差异，同时行相关性分析示COX2、VEGF和MVD两两间均存在正相关。这些均提示粘连形成与血管发生之间存在密切关系，其可能通过COX2介导前列腺素途径上调VEGF等血管生成因子而促进血管生成，从而在粘连发生发展中发挥重要作用。

　　综上所述，COX2、VEGF参与了人体术后腹腔粘连的发生、发展，其可能机制与通过一种相互正反馈介导粘连组织血管的发生有关。但是，具体机制及相关的分子生物学通道等仍需进一步研究。若能明确术后腹腔粘连形成的确切机制，则有利于进行针对性的干预治疗，更好的预防腹腔粘连这一顽固的外科手术并发症。

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