IFNγ对兔盆腔术中照射后直肠组织TGFβ1mRNA含量的影响

　　　　作者：张丽，王华，王娟，杨蕴一，刘孜

【摘要】 目的 探讨IFNγ对兔盆腔术中照射后直肠组织的病理变化和转化生长因子β1(TGFβ1)含量的影响。方法 54只雌性新西兰大白兔随机分成单纯照射组、药物干预组和空白对照组，盆腔术中照射后当天开始每隔4 d给予药物干预组肌注IFNγ 2.5×104u/(kg·f)，共5次;于照射后第4、8、12、16、20周每组分别处死5只兔，空白对照组于实验完成时统一处死，光镜下分别观察直肠组织的病理变化，原位杂交法检测TGFβ1mRNA的表达变化。结果 光镜下观察直肠组织病理改变及原位杂交TGFβ1mRNA含量，对比药物干预组与单纯照射组和空白对照组间均有显著性差异(P<0.05)。结论 IFNγ能明显抑制TGFβ1mRNA的表达，可减轻早期放射性炎症反应及后期放射性纤维化的程度。

【关键词】 术中照射;干扰素γ;转化生长因子β1;放射性直肠损伤

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of interferonγ (IFNγ) on pathological changes and transforming growth factorβ1 (TGFβ1) changes in rectal tissues of rabbits which received introoperative radiotherapy (IORT).Methods Fiftyfour big female New Zealand albino rabbits were randomly allocated into simple irradiation group， IFNγ treatment group and blank control group. IFNγ (2.5×104u/kg·f) was injected into IFNγ treatment group every four days after IORT for five times. Five rabbits were randomly sacrificed at 4， 8 12， 16 and 20 weeks after IORT except those in blank control group. Pathological changes of the rectum were observed under light microscope and the level of TGFβ1 mRNA expression was observed by hybridization in situ.Results Light microscopy showed that the pathological changes and the mRNA expression of TGFβ1 in IFNγ treatment group at different time phases were significantly lower than those in simple irradiation group and blank control group (P<0.05).Conclusion IFNγ can significantly inhibit the mRNA expression of TGFβ1， abate acute factitial proctitis and radiationinduced rectal fibrosis.

　　KEY WORDS: introoperative radiotherapy; interferonγ; transforming growth factorβ1; radiationinduced rectal injury

　　盆腔肿瘤是临床上常见的恶性肿瘤，约占恶性肿瘤的30%[1]，且发病率有逐年上升的趋势。其治疗原则强调手术、放疗、化疗等综合治疗，放疗为其中重要的治疗手段之一。如宫颈癌及子宫内膜癌的治疗过程中，约有90%的患者需要接受放射治疗，且其疗效与放射剂量有明显的相关性[2]。但是，放射线在杀灭肿瘤细胞的同时，不可避免要损伤正常细胞。放射性直肠损伤的发生成为盆腔肿瘤放射治疗中公认的剂量限制性因素。因此，放射性直肠纤维化成为部分盆腔肿瘤患者放射治疗后常见的晚期并发症。

　　近年来，转化生长因子β1(transforming growth factorβ1， TGFβ1)与放射性纤维化的关系研究受到重视[3]。干扰素γ(interferonγ， IFNγ)是一种抗组织纤维化的细胞因子。体外实验表明其能够抑制成纤维细胞的增殖和胶原的合成，拮抗TGFβ1的促纤维化效应[4]。本实验模拟临床术中放射治疗的过程，通过手术中一次性大剂量照射兔盆腔组织造模，并早期使用IFNγ进行干预，拟探讨IFNγ对照射后兔直肠组织内TGFβ1合成和分泌的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康成年雌性新西兰大白兔54只，体质量(2000±200)g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。注射用重组人干扰素γ购自上海克隆生物高技术有限公司(1×107万IU/瓶，国药准字S10980084);鼠抗兔Ⅲ型胶原单克隆抗体为美国Merck公司产品;TGFβ1(mRNA)ISH DIG Kit为天津颢洋生物制品科技有限责任公司产品;即用型SABC免疫组化试剂盒及浓缩型DAB试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 分组 54只成年雌性新西兰大白兔随机分为3组，其中单纯照射组25只，药物干预组25只，空白对照组4只。

　　1.3 术中照射方法 将兔麻醉后仰卧位固定于特定兔固定架上，在X线模拟机下确定照射野：上界至耻骨联合上缘4cm，下界到耻骨联合，左右界分别为中线旁2cm，射野大小为4.0cm×4.0cm。兔开腹后给予6Mevβ射线直视下单次大剂量照射，剂量为20Gy。照射完毕后关腹结束手术。空白对照组兔行相同手术，但不予照射。

　　1.4 术中照射设备 术中照射设备采用有机玻璃制作的盆腔φ4限光筒，其横截面为椭圆形，组织接触端为与盆腔组织良好吻合的曲面，照射野为耻骨联合上

　　4.0cm×4.0cm范围。

　　1.5 给药及观察方法 药物干预组于术后当天开始，以后每隔4d肌注IFNγ 2.5×104u/(kg·f)，共5次，单纯照射组和C组同期给予肌注5mL生理盐水。每日观察兔子活动、进食及排泄情况，每周称量体重。

　　1.6 标本采集及检测方法 单纯照射组与药物干预组于术中放疗后第4、8、12、16、20周分别随机处死5只兔子，取直肠组织分别进行以下操作：①石蜡包埋，切片行HE染色;②组织室温固定，石蜡包埋后制作4μm切片，原位杂交染色，细胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。空白对照组兔子于实验完成时处死、取材，进行相同的组织处理。

　　1.7 病理学的观察 参照SZAPIEL等[5]评价肺炎及肺纤维化的方法评价放射性直肠炎或纤维化的程度，并按照张东伟等[6]提供的计算肺损伤的病理半定量分析法进行直肠损伤病理半定量分析：无放射性直肠炎或纤维化(-，1分)，组织无充血水肿;轻度直肠炎或纤维化(+，2分)，组织稍有充血，水肿，增厚且阳性细胞表达率<20%;中度直肠炎或纤维化(，3分)，直肠组织充血水肿明显，表面有点状纤维化病灶且阳性细胞表达率在20%～50%之间;重度直肠炎或纤维化(，4分)，组织表面纤维化病变呈片状，增厚明显，色灰白且阳性细胞表达率>50%。

　　1.8 原位杂交结果的判断标准 采用双盲法观察切片，染色结果应用电脑图像采图软件NIKON&Spot彩色病理图文分析系统进行图像采集，以图文分析软件IMAGEPro plus 5·0采集直肠组织原位杂交和免疫组化图像，将直肠组织各时点切片随机取染色区域5个高倍视野(×400)，测量并记录每个视野阳性染色的平均积分吸光度(IA)值。半定量积分法判断结果：①阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分;②阳性强度：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将①、②两者积分相乘，0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性。

　　1.9 统计学处理 所有数据均以±s表示，经SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用χ2检验，以P<0.05表示有显著性差异。

　　2 结 果

　　2.1 大体标本的观察 空白对照组无明显变化;单纯照射组解剖肉眼可见照后4周直肠组织充血、水肿明显，12周组织增厚、色灰白，16周组织增厚更明显，表面明显点状纤维化病灶，20周可见纤维化病变呈片状。干预组照后4周也出现轻度充血水肿，12及16周未有明显组织增厚，20周无明显纤维化病变。

　　2.2 病理学的观察 HE染色可见对照组直肠组织结构正常;单纯照射组照后第4周未见明显病理学改变，照后8周即出现急性炎症反应，组织充血水肿明显，并有红细胞、巨噬细胞、淋巴细胞聚集，12周时急性炎症减轻，组织仍有充血水肿，16周时急性炎症消退，胶原组织增生，成纤维细胞及淋巴细胞显著增多，20周时胶原组织增生及炎细胞浸润更加明显，增生的胶原组织主要分布在黏膜下层以及肌层之间的疏松结缔组织内。IFNγ干预组直肠组织于照射后8周也出现急性炎症反应，但程度明显低于单纯照射组，仅有少量炎细胞浸润，20周时成纤维细胞及淋巴细胞均少于同时期单纯照射组，局部纤维化呈点灶状(表1、图1)。表1 各组直肠组织病理分级和积分的比较

　　A：IFNγ干预组8周时的HE染色;B：IFNγ干预组20周时的HE染色;C：单纯照射组8周时的HE染色;D：单纯照射组20周时的HE染色。

　　3.3 原位杂交的结果 正常兔直肠组织在背景染色基础上仅在肠隐窝上皮细胞和肠腺嗜酸性细胞中可见TGFβ1 mRNA杂交信号的弱表达或不表达，单纯照射组和对照组在直肠黏膜固有层的炎细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及成纤维细胞的胞浆中表达为主，围绕细胞核呈棕色颗粒状或团块状分布。照射后4周，即可见TGFβ1 mRNA杂交信号增强，8周时 TGFβ1 mRNA杂交信号明显增强。随着时间推移，TGFβ1 mRNA阳性表达率逐渐增多，至观察截止时间20周时表达达高峰;且单纯照射组、IFNγ干预组TGFβ1 mRNA原位杂交信号与胶原含量呈正相关。其中IFNγ干预组与单纯照射组各时间点相比杂交信号明显减弱，差异有显著性(P<0.05)，单纯照

　　射组和对照组各时间点相比差异有统计学意义(P<0.05)，IFNγ干预组与对照组间差别无统计学意义(表2、图2)。表2 各组直肠组织TGFβ1 mRNA原位杂交平均吸光度的比较

　　A：IFNγ干预组8周时的ISH染色;B：IFNγ干预组20周时的ISH染色;C：单纯照射组8周时的ISH染色;D：单纯照射组20周时的ISH染色。

　　3 讨 论

　　目前，已有较多肝、肾、肺等器官放射性纤维化研究的报道。其中单次大剂量肺损伤模型的建立较多[79]，但是采用术中一次大剂量照射观察放射性直肠损伤的模型国内外鲜有报道。本研究采用术中一次性大剂量照射法建立兔放射性直肠损伤模型，观察到放射性直肠损伤的病理变化过程大致分为：①急性炎症期;②增生期;③纤维化期。本实验观察结果提示：根据病变规律能够成功建立兔放射性直肠损伤模型。放射性直肠损伤病理改变是一个动态发展的过程，但也可观察到在同一时间点获取的病理标本存在不同时期的病变。

　　IFN是一种具有多功能的细胞因子。自上世纪50年代被发现以来，因其抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用而广泛应用于临床。然而，近年来IFNγ的抗纤维化作用已成为国内外研究的一个热点[1012]。本实验研究了IFNγ是否对放射性直肠损伤有防治作用。从形态学上观察，结果显示单纯照射组随着时间推移胶原组织增生及炎细胞浸润更加明显，增生的胶原组织主要分布在黏膜下层以及肌层之间的疏松结缔组织内;IFNγ干预组兔放射性直肠炎病变轻微，发生时间迟，进展缓慢，程度较单纯照射组明显轻且几乎不形成纤维化。这表明IFNγ具有抗直肠放射性损伤的作用。

　　TGFβ1是一类促纤维化细胞因子，在组织重建过程和伴发的免疫反应中起重要作用[1315]。本研究采用术中一次性大剂量照射法建立兔放射性直肠损伤模型，观察TGFβ1 mRNA的变化。结果表明照射后直肠组织TGFβ1的表达强度明显升高，且其表达时间早于病理学观察的成纤维细胞与淋巴细胞大量增殖的旺盛时期。说明TGFβ1可能介导并调控了放射性直肠纤维化的“启动阶段”，放射性直肠损伤的形成与TGFβ1表达增加有关，其强烈的作用主要发生在照射后期即纤维化形成时期，抑制TGFβ1的表达可望为疾病带来治疗效果。

　　总之，本实验从组织病理、分子水平观察了IFNγ对放射性直肠损伤的调控作用，且实验所复制的动物模型基本与临床发病过程相符。从而在理论上，初步探讨了IFNγ防治放射性直肠可能的分子病理机制;在实践上，为临床选择有效的抗放射性损伤药物提供依据，也为指导临床治疗提供理论基础和可靠的实验数据。但是，由于我们的样本量相对较少，观察时间较短，且实验结果仅采用半定量分析，仅对IFNγ抑制放射性直肠炎或纤维化的机制做了初步解释，其中具体的信号传导及细胞因子间的相互作用仍有待于进一步的深入研究。

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